[发明专利]一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，采用壳聚糖、罗望子胶－戊二醛交联吸附的方法，将褐藻胶裂解酶固定于介质之上，它包括壳聚糖载体的精制、交联试剂的配制、壳聚糖、罗望子胶－戊二醛的交联、褐藻胶裂解酶的提取及固定等步骤。本发明所制备的褐藻胶裂解酶固定化酶，催化能力和对不同环境(温度、pH、贮存时间)的稳定性都有明显提高，用固定化酶处理海藻酸钠，采用离子树脂吸附降解产物，筛网过滤的方法回收固定化酶，采用超滤膜过滤的方法回收游离状态的酶，可以反复利用，提高了褐藻寡糖的得率，生产过程简单，生产成本大幅度下降，满足了褐藻寡糖产品的工业化生产要求。

技术领域

本发明涉及一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，涉及酶的固定化技术领域，特别是使用壳聚糖等生物多糖作为介质固定化褐藻胶裂解酶的制备方法。

背景技术

褐藻寡糖具有良好的亲水、稳定、高粘、无毒等特点，并且具有独特的生物活性，如促植物生长、提高抗逆性等，在医疗、肥料领域有广阔的应用潜力。褐藻寡糖由褐藻胶降解而来，传统的化学法使用强酸强碱或强氧化剂，产物以饱和寡糖为主。酶解法作用温和，主要断裂糖醛酸之间的化学键，得到的是不饱和寡糖，其生理活性更好。并且酶解法过程简单，副产物少，对环境友好，在未来必将替代化学方法。褐藻胶裂解酶是指可以专一催化断裂褐藻胶分子中糖苷键的一类酶，目前已经有70多种从藻类、海洋动物及微生物种分离出来，但商品化的寥寥无几。该酶在自然界中分泌量较少，提取困难，成分较高。且酶催化收环境温度和pH影响，稳定性较差，限制了其作为工业酶制剂的开发。

随着酶工程学的蓬勃发展，酶固定化技术的相关理论和实践技术日新月异。酶固定化方法可以分为吸附法、交联法共价偶联法、包埋法等几种，其中吸附法是通过载体表面与酶分子之间次级键相互作用而实现的固定化方法，具有操作简单、酶活保留率高的优点。而交联法是借助交联试剂的交联作用形成介质网格结构的固定化法，具有载量大，稳定程度高的优点。壳聚糖是一种天然碱性多糖，本身具有无毒无害、耐酸耐温的特点，使用壳聚糖作为固定化介质，制备褐藻胶裂解酶制剂，可以提高褐藻胶裂解酶的稳定性，实现酶制剂回收循环，减少化学试剂污染。但现有技术中，以壳聚糖作为酶固定化介质，多需辅以一定的载体，如改性膨胀蛭石(专利2018107277719)、聚乙烯醇纳米纤维(专利2016101545665)、大孔吸附树脂(专利201210062682X)等，因此开发高固定化率、稳定性好、耐酸碱环境优良、成本低等优势的褐藻胶裂解酶固定化酶是本领域亟需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术中的不足，提供一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，得贮藏和操作稳定性良好的固定化褐藻胶裂解酶。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于它是利用壳聚糖-罗望子胶-戊二醛交联的方法制备固定化介质，之后通过活化加入游离褐藻胶裂解酶，制得固定化褐藻胶裂解酶，其具体步骤如下:

(1)将壳聚糖与罗望子胶混合后研磨成粉，过60目筛，室温下浸泡4h，冲洗掉杂质，抽滤后烘干；

(2)将壳聚糖-罗望子胶混合物用3％的乙酸溶液溶解，终浓度为2％-5％，超声至气泡消失变成透明凝胶；取凝胶加入至凝结液中，硬化过夜，水洗至中性，4℃保存；

(3)称取壳聚糖-罗望子胶小球置于戊二醛溶液中，缓冲液pH为5-7之间，30℃下浸泡并温和搅拌1-5h，静置并去除上清液，使用同样pH缓冲液反复冲洗交联后的小球，并抽滤除去多余的戊二醛，4℃保存；

(4)向交联后的壳聚糖-罗望子胶小球中加入一定量的褐藻胶裂解酶，用缓冲液稀释后，温和搅拌静置3h，之后再温和搅拌一次，4℃静置过夜；去除上清液得到固定化褐藻胶裂解酶。

上述壳聚糖的分子量为20000～50000Da，优选30000～40000Da。

上述壳聚糖与罗望子胶的质量比为3～5:1。