[发明专利]一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法

权利要求书

1.一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法，其步骤是：

A、采集待测水样，经0.22μm或0.45μm的滤膜过滤，将过滤得到的藻类样本进行总基因组DNA的提取和纯化；

B、将提取纯化的DNA通过荧光定量PCR对rbcL基因进行扩增和定量，荧光定量PCR的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，目标产物大小为280bp，反应完成后记录样品的Ct值；

C、标准曲线的制作：取细胞密度已知的单种培养或纯培养硅藻作为标准藻株，提取其基因组总DNA，梯度稀释后作为标准模板，依照上述荧光定量PCR方法与待测样品同时进行定量PCR扩增，反应结束后，根据标准藻株各个稀释浓度梯度的Ct值绘制荧光定量PCR标准曲线，作为待测水样中硅藻细胞密度的计算依据；待测样品的Ct值应落在绘制标准曲线的Ct值范围内；

D、根据待测样品的Ct值和标准曲线计算样品rbcL基因的拷贝数，样品中硅藻的细胞密度等同于所述的拷贝数；

步骤C中的标准藻株选自直链藻、小环藻、冠盘藻、脆杆藻或针杆藻中的任意一种；

荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性5min，接着40个循环，每个循环包括95℃15s、60℃30s和72℃30s，每个循环完成后进行一次荧光检测。