[发明专利]一种香蕉枯萎菌milRNA

说明书

本发明公开了一种香蕉枯萎菌编码内源milRNA。本发明通过Deep sequencing深度测序获得了香蕉枯萎菌编码的内源milRNA，为后续进一步开发、利用小RNA在香蕉枯萎菌中的作用机制提供前期工作铺垫。

本申请为申请号CN201810175831.0，申请日20180302，发明名称“香蕉枯萎菌milRNAs及低丰度milRNAs的体外验证方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及香蕉枯萎菌milRNA。

背景技术

1、植物内源miRNA在转录后以基因沉默的方式负调控靶标基因的表达，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用

真核生物的小RNA主要分为microRNAs(miRNAs)、siRNAs和piRNAs。miRNA和siRNA长度约为20～25nt，均由类似RNase III的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生，它们的形成既有联系又有区别。siRNA途径是由是外源入侵，如病毒，转座子以及转基因等产生变体dsRNA引发的；而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCLs(或Dicer类似蛋白)剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体(RNA-InducedSilencing Complex,RISC)，以PTGS的方式作用序列同源的mRNA，通过mRNA剪切、翻译抑制或者甲基化等方式调控基因的表达。piRNA依赖PiWi蛋白加工成熟，仅存在动物细胞。

植物内源miRNA是由Ⅲ型RNase核酸酶Dicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过转录后水平以mRNA剪切或翻译抑制的方式沉默序列同源的mRNA靶标基因。miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。已经有大量的报道证实植物内源miRNAs参与植物对病原菌的PTI和ETI免疫，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用。

2、真菌中存在与植物miRNA在结构、长度、作用方式上类似的小RNAs(microRNA-like RNAs，milRNAs)。

milRNAs最早在粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)中发现的，与植物microRNA在结构、小RNA长度以及作用方式上非常相似，因为与植物的miRNA类似而命名microRNA-likes(milRNAs)。粗糙脉孢霉的milRNAs通过Dicers，QDE-2，核酸外切酶活性的QIP效应蛋白以及具有III型RNase功能域的线粒体核糖体大亚基MRPL3蛋白(mitochondrial ribosomalprotein large subunit,MRPL3)的不同组合，产生有四种不同的生物形成途径。虽然四种途径中从基因间隔区转录的RNA前体序列长度各异，但都具有发卡结构，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能够特异与Argonaute(AGO)蛋白结合；此外，实验证明milR-1可以通过基因沉默的方式作用调靶标序列(NCU07311)mRNA，主要通过抑制mRNA翻译的方式进行，与植物microRNA通过mRNA剪切和抑制转录的方式不一致(Lee et al.,2010)。milR-1是构巢曲霉中丰度最高的miRNA-like RNAs，Xue et al.(2012)以milR-1为研究对象构建了依赖AGO的milR-1离体生物形成的生物化学研究框架，研究表明milR-1的加工成熟过程可以分为5个步骤，与植物microRNA的生物合成途径不一样的是，除了QDE-2，Dicer等核心蛋白组分外，还需要QIP以及RNA外来复合体(exosome)的共同参与，加工成为成熟的小RNA(Xueet al.,2012)。