[发明专利]一种香蕉枯萎菌低丰度milRNAs的体外验证方法

说明书

本发明公开了一种香蕉枯萎菌低丰度milRNAs的体外验证方法，包括以下步骤：S1、在香蕉枯萎菌的基因组DNA中设计引物扩增含有候选milRNA骨架的DNA序列，将所述DNA序列连接到表达载体上；S2、构建好的载体转化到农杆菌感受态细胞，进行LB培养，得菌液；S3、用步骤S2所得菌液浸润本生烟叶片，取叶片进行对应的小RNA探针杂交检测，判断候选milRNAs发夹序列是否可以加工成为成熟的milRNA。本发明方法利用本生烟作为替代植物，可以对milRNAs的靶标及其功能进行有效的分析，可以对深度测序的数据进行高通量的分析和验证，克服了目前小RNA研究中的不足，具有广泛的应用前景。

本申请为申请号CN201810175831.0，申请日20180302，发明名称“香蕉枯萎菌milRNAs及低丰度milRNAs的体外验证方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种香蕉枯萎菌低丰度milRNAs的体外验证方法。

背景技术

1、植物内源miRNA在转录后以基因沉默的方式负调控靶标基因的表达，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用

真核生物的小RNA主要分为microRNAs(miRNAs)、siRNAs和piRNAs。miRNA和siRNA长度约为20～25nt，均由类似RNase III的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生，它们的形成既有联系又有区别。siRNA途径是由是外源入侵，如病毒，转座子以及转基因等产生变体dsRNA引发的；而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCLs(或Dicer类似蛋白)剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体(RNA-InducedSilencing Complex,RISC)，以PTGS的方式作用序列同源的mRNA，通过mRNA剪切、翻译抑制或者甲基化等方式调控基因的表达。piRNA依赖PiWi蛋白加工成熟，仅存在动物细胞。

植物内源miRNA是由Ⅲ型RNase核酸酶Dicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过转录后水平以mRNA剪切或翻译抑制的方式沉默序列同源的mRNA靶标基因。miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。已经有大量的报道证实植物内源miRNAs参与植物对病原菌的PTI和ETI免疫，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用。

2、真菌中存在与植物miRNA在结构、长度、作用方式上类似的小RNAs(microRNA-like RNAs，milRNAs)。