[发明专利]荧光蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种荧光蛋白及其制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明筛选出了一种新型红色大斯托克斯位移的荧光蛋白，它可与绿色荧光蛋白一起在单光子和多光子显微成像中有效的同时被单色光激发进行多色成像，它不仅单体性好，而且光稳定性也得到了较大改善。同时，它可以作为供体与受体荧光素酶结合，在生物体内形成一种新的高灵敏的生物发光共振能量转移系统。在检测细胞内分子间相互作用时，该生物发光共振能量转移系统的动态范围比传统的生物发光共振能量转移系统提高了2.27倍。应用本发明提供的应该蛋白，提高了BRET系统的效率，提高了利用生物发光共振能量转移系统对检测分子间相互作用的动态范围。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种荧光蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

随着后基因组时代的来临，作为生物体结构的重要组成成分和生物性状的体现者，蛋白质研究越来越多的成为生命科学研究的焦点，尤其是在蛋白质-蛋白质相互作用方面。传统的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交、免疫共定位、串联亲和纯化、质谱鉴定和免疫共沉淀等，它们都对细胞结构有破坏性。荧光共振能量转移(FRET)和生物发光共振能量转移(BRET)，克服了传统的检测方法的限制，可以在无损细胞的情况下，实时监测细胞内蛋白质-蛋白质间的相互作用。

BRET首先发现于海洋生物维多利亚水母中，是一种非辐射的能量从供体到受体的转移过程。BRET有两个融合蛋白，一个融合能量供体荧光素酶，一个融合能量受体荧光蛋白，荧光素酶由加入的底物(如腔肠素等)来激活。当两个融合蛋白发生相互作用，并且距离小于10nm，供体便会发出能量转移到受体；如果不发生作用，则只能检测到供体氧化底物发出的光。

生物发光由于其不需要光激发(而荧光需要光激发)，背景低的特点，已成为活体光学成像的重要手段之一。然而较亮的荧光素酶(通过与底物的生化反应而产生光子)不仅量子产率低，而且发射光子的波长较短(激发峰600nm)，因此限制其在动物体内的应用。基于荧光素酶和荧光蛋白的生物发光共振能量转移(BRET)则很好的解决了上述认为问题。然而，目前基于BRET的生物发光探针中的红色荧光蛋白的量子产率相对较低(0.4)，而且荧光素酶的发射光谱与荧光蛋白的吸收谱重叠较少，从而导致BRET效率较低。

因此，需要找到一种能与目前最亮的荧光素酶在光谱上有高重叠，而且其发射峰在～600nm处的荧光蛋白。现有的满足该条件的荧光蛋白包括CyOFP1或mCyRFP1等。但CyOFP1是一个二聚体，融合性能较差，不利于其应用于构建分子探针，而mCyRFP1的光漂白性差，不利于长时成像。此外，现有的BRET系统效率虽相较于之前已经有所提高，但仍需进一步提升。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种荧光蛋白，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供一种表达上述荧光蛋白的核酸，可以表达出上述荧光蛋白。

本发明的第三个目的在于提供一种含有上述核酸的宿主细胞，可用于克隆和制备上述荧光蛋白。

本发明的第四个目的在于提供一种包含上述荧光蛋白的试剂盒。

本发明的第五个目的在于提供上述荧光蛋白的生产方法，该方法工艺简单，操作方便，能够准确地得到目的荧光蛋白。

本发明的第六个目的在于提供上述荧光蛋白的应用。

本发明提供了一种荧光蛋白，所述荧光蛋白为如下(a)-(c)：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中N12、R14、Q27、L80、A108、E118或V125位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成；

(b)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中N45位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成；