[发明专利]一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法

权利要求书

1.一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：将磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水混合均匀得到酶-底物混合物，然后在23-27℃温度条件下震荡5-8min以完成修饰操作，接着对修饰操作后的混合溶液进行冷冻干燥，得到的干粉物质即为生物印迹磷脂酶；

第二步：将20mM的磷酸缓冲溶液加入到装有转子、冷凝管、温度计的三角烧瓶中，加热至33-37℃后加入第一步制得的生物印迹磷脂酶，待其溶解后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1.8-2.2倍的碳二亚胺，反应0.8-1.2 h后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1-1.5倍的修饰剂单甲氧基聚乙二醇酰肼，修饰反应完成后将修饰操作后的混合溶液在20mM磷酸缓冲液中透析，透析结束后得到纯化的修饰酶液；

第三步：在一反应容器中加入纯化的修饰酶液、磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物和20mM的柠檬酸缓冲液，然后将所述反应容器放入水浴摇床，在28-32℃条件下固定化反应1.8-2.2 h，然后加入体积分数为4.5-5.5%的戊二醛作为交联剂，在28-32℃条件下反应1～5h后得到固定化酶，再用20mM柠檬酸缓冲液对所述固定化酶进行洗涤后得到磁性固定化磷脂酶；

所述磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备方法包括下列步骤：

S1、将壳聚糖溶解于水中，然后调节pH值至4-5得到壳聚糖溶液；通过超声处理将油酸分散于乙醇中，然后加入碳二亚胺并磁力搅拌，0.8-1.2h后，加入N-羟基琥珀酰亚胺得到混合溶液，接着将所述混合溶液滴加到壳聚糖溶液中，并在85-95℃反应10-14h完成改性，然后使用3KDa中空纤维束膜超滤去除水溶性的副产物，再对超滤后的溶液进行冷冻干燥，得到的冻干粉用乙醇分散后用0.22μm的尼龙滤纸过滤，重复两次以上，得到的滤渣再经真空冷冻干燥后即为油酸改性的壳聚糖；壳聚糖与水的质量比例为4.5~5.5：1；所述油酸的摩尔量与壳聚糖单体摩尔量之比为0.18~0.22：1；碳二亚胺的摩尔量与油酸的摩尔量之比为4.5~5.5：1；N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量与油酸摩尔量之比为4.5~5.5：1；

S2、将碳二亚胺加入到磁性氧化石墨烯悬浮液中，并用2（N-吗啉）乙磺酸调pH值到5.5-5.7，超声处理10~20min后加入N-羟基琥珀酰亚胺，并用磷酸缓冲盐溶液调节pH值到7.1-7.3，得到活化的磁性氧化石墨烯溶液；通过超声处理，将油酸改性的壳聚糖分散于乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液，然后将油酸改性的壳聚糖溶液滴加到所述活化的磁性氧化石墨烯溶液中，在室温条件下超声处理5-7h，接下来在室温条件下，震荡7-9h，反应结束后得到磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物；碳二亚胺与磁性氧化石墨烯悬浮液的质量比为3-5：1。

2.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法，其特征在于：在第一步中，将质量浓度为4.5~5.5%的磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水按照4.8~5.2：0.8~1.2：4.7~5.3：0.8~1.2的体积比混合均匀，得到酶-底物混合物；所述柠檬酸盐缓冲液为0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH值为 4.5-6.5。

3.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法，其特征在于：所述磷脂酶为磷脂酶A1和磷脂酶A2中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法，其特征在于：在第一步中，先在-85~-75℃温度环境中对修饰操作后的混合溶液冷冻30-35min，然后在真空干燥机中以真空表压-0.09~-0.10MPa、温度-50~-40℃的参数，冷冻干燥24-30h。

5.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法，其特征在于：所述纯化的修饰酶液、20mM的柠檬酸缓冲液和体积分数为4.5-5.5%的戊二醛之间的体积比例为2~10：45~55：0.8~1.2；所述20mM柠檬酸盐缓冲液的pH值为4.5-6.5，所述纯化的修饰酶液与磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的体积质量比为2~10ml：2g。