[发明专利]引物组合及其在鸡的种属鉴定和/或鸡肉鉴定中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其在鸡的种属鉴定和/或鸡肉鉴定中的应用。该引物组合特异性强，且能准确鉴定样品中鸡或鸡肉。使用LAMP技术在实时荧光PCR仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的鸡肉核酸DNA。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它PCR方法具有更高的特异性，比现有的同类方法具有更快的检测速度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其在鸡的种属鉴定和/或鸡肉鉴定中的应用。

背景技术

肉是我们人类优质蛋白质和多种营养素的主要来源，含有丰富的必须氨基酸和多种微量元素。近年来，随着我国居民生活水平的提高，仅国内生产的肉类远不能满足市场需求，需要从国外进口部分肉类。这些因素为国内外不法商贩乘虚而入创造了条件，在市场上肉的掺假和欺诈行为也越来越受到人们的关注。其中，鸡肉以其鲜嫩的口感和实惠的价格受到许多消费者的喜爱。但同时，鸡肉也常常被用作掺假肉来冒充一些名为鱼丸、羊肉串等半加工食品，且这种情况比比皆是。所以，为了保障消费者合法权益，确立有效的肉源性成份鉴定方法是十分必要。

对于现今社会而言，传统的依靠感官和经验的肉类形态鉴别方法已经不能满足市场对肉制品掺假现象进行控制监管的需要。目前对肉类产品的鉴定方法主要在蛋白质和核酸水平进行。在蛋白质水平，常用ELISA和高效液相色谱等技术进行检测，其局限性在于对仪器、试剂和样品处理要求高，且检测加工样品时特异性和准确性较差，费时费力。相对来说，检测核酸的方式更方便准确。在核酸水平，常用的核酸水平检测技术有PCR与实时荧光PCR。PCR技术是目前最常用的检测肉源性成分的方法，因为其具有较高的灵敏度、特异性和可操作性。但一般的PCR反应至少1.5h，且后期检测需要使用基因测序和凝胶电泳，而凝胶电泳中的EB具有强致癌性，具有一定的安全隐患。而实时荧光PCR需要昂贵的仪器及试剂，且反应时间至少1.5h，且对操作人员有较高要求，难以在基层得以推广。

现有技术公开了一种检测鸡肉的LAMP引物，该引物在总反应时间90min内检测出的极限为5pg的核酸，其使用的可视化法是在反应结束后，观察反应后的体系是否变浑浊，这种方法虽然简便，但由于个体差异和没有标准的判读范围，很容易在结果判读时造成假阳或假阴的结果误判。另一种可视化方法是在反应后开盖加入染料使其显色，这个过程中极其容易造成产物污染，导致其他检测指标出现假阳性现象。而本发明中提到的检测鸡肉的LAMP引物，在总反应时间50min内即能检测到5pg的核酸，且使用荧光法LAMP进行检测，可以实时观察结果，避免了造成污染的风险。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了特异性强，且能准确鉴定样品中鸡肉的特异性LAMP引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了线粒体Cytb基因在鸡的种属鉴定和/或鸡肉鉴定中的应用。

此外，本发明还提供了一种标志物，具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在此基础上，本发明还提供了具有如SEQ ID NO:7所示序列的核苷酸作为标志物在鸡的种属鉴定和/或鸡肉鉴定中的应用。

在上述研究的基础上，本发明还提供了引物组合，包括：引物-F3、引物-B3、引物-FIP、引物-BIP、引物-LF和引物-LB；

所述引物-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(I)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(II)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；