[发明专利]一种合成β-法尼烯的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种合成β‑法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明基因工程菌敲除了酿酒酵母中GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和HMG1基因，其中利用的启动子和终止子分别为P_GAL1，P_GAL10，P_GAL4和T_CYC1，T_ADH1。利用该基因工程菌的生物转化能力，结合玉米水解液为培养基，能够低成本、绿色、环保地生产β‑法尼烯。利用本发明基因工程菌发酵，β‑法尼烯的产量可达56mg/L。本发明基因工程菌以及合成β‑法尼烯的方法适用于实际工业生产。

技术领域

本发明涉及一种合成β-法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

法尼烯（C15H24），密度0.813 g/cm³，是一种无环倍半萜，它由苹果、青蒿等植物中产生来对抗外界昆虫或动物的侵害(Nieuwenhuizen et al., 2014; Yang et al.,2011)，而其吸湿性低和高能量密度的特点使其成为高密度燃料的研究对象。

随着合成生物学的不断发展，以微生物作为细胞工厂合成法尼烯成为一种可持续、快速、绿色的生产方法。然而，目前，在微生物细胞中生产法尼烯并不理想，利用微生物生产法尼烯一直缓慢前行，未能实行工业化生产。现有报道中，大肠杆菌作为底盘细胞产生法尼烯发酵生产α-farnesene的产量能够达到380 mg/L(Zhu et al., 2014)，生产β-farnesene8.74 g/L (Utilization of biodiesel by-product as substrate for high-production of β-farnesene via relatively balanced mevalonate pathway in E.coli)，但是，以质粒形式存在的游离基因在发酵过程中不稳定，易丢失，不利于大规模的发酵生产。

除大肠杆菌外，酿酒酵母具有成熟的真核表达系统，拥有天然的甲羟戊酸(MVA)途径，为异源萜类化合物的合成提供了直接前体香叶基焦磷酸（GPP），因此酿酒酵母细胞具有合成异源萜类化合物的天然优势。目前，其中Chandran等人首先利用酿酒酵母作为生产细胞，异源表达青蒿中β-farnesene合成酶，达到了100 g葡萄糖转化成23.8 g β-farnesene的研究( Chandran et al., 2011)；后来，Tippmann等人同样利用酿酒酵母和异源的三个萜品烯合成酶来表达α-farnesene，补料分批培养的产量达到170 mg/L(Tippmann et al.,2015)；Adam等人最终通过改造酿酒酵母的代谢平衡将β-farnesene产量提升到110 g/L。然而蔗糖价格较高，发酵成本过高，不适于大规模发酵生产，这就限制了其应用。

发明内容

为解决低成本生产β-法尼烯的方法，本发明提供了一种利用玉米水解液作为培养基，具有β-法尼烯合成能力的基因工程菌及其应用，采用的技术方案如下：

第一，本发明的目的在于提供能够合成β-法尼烯的基因工程菌，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了自身的内源基因GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了β-法尼烯合成酶基因AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和tHMG1基因，所需的启动子和终止子分别为P_GAL1，P_GAL10，P_GAL4和T_CYC1，T_ADH1。