[发明专利]一种放流中国对虾资源的调查方法

权利要求书

1.一种放流中国对虾资源的调查方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤

1)自中国对虾放流后，在调查海域采集水样，并用0.45μm的玻璃纤维滤膜结合真空过滤装置过滤2L海水进行样品的富集，收集的样品准备进行eDNA的提取；

2)提取步骤1)收集样品的eDNA，并将eDNA稀释到定量PCR所要求的浓度范围以内；

3)采用荧光定量检测系统进行样品eDNA的定量分析，荧光定量检测系统根据荧光值的变化生成中国对虾mtDNA COI基因的标准曲线与扩增曲线,从而自动得出未知浓度eDNA样品中中国对虾mtDNA COI基因的拷贝数；根据定量PCR的结果最终确定中国对虾在自然海域中的时空分布与资源量动态变化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)其中每个采样点做3次采样重复。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中实时荧光定量PCR的引物以及探针的序列如下：

正向引物的序列为SEQ ID NO:1,反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQID NO:3。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的探针的5＇端用FAM标记，3＇端用BHQ1标记。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，所述的实时荧光定量PCR的反应体系为20μl反应体系，其中包括10μL 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix，0.4μL权利要求3所述的正向引物，0.4μL权利要求3所述的反向引物，0.4μL权利要求3所述的探针，2μL模板DNA，6.8μLPCR-grade water。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中所述的实时荧光定量PCR的扩增反应程序为2步法：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃退火延伸34s，40个循环。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，中国对虾mtDNA COI基因的标准曲线构建中，所用的普通PCR引物，其中正向引物的序列为SEQ ID NO:4，反向引物的序列为SEQ ID NO:5。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，中国对虾mtDNA COI基因的标准曲线构建中普通PCR的反应体系为：50μl反应体系，其中10×Taq Buffer 5μL，2.5mM的dNTPs 1μL，10mM正反向引物各1μL，5U/μL Taq DNA Polymerase 1μL，50ng/μL模板DNA 2μL,25mM MgCl₂ 3μL，ddH₂O 36μL。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，中国对虾mtDNA COI基因的标准曲线构建中普通PCR的反应的扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复延伸10min；4℃保存并结束程序。