[发明专利]一种低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法

权利要求书

1.一种基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)神经细胞培养48～72h后收集培养上清液，离心去除悬浮细胞后得到第一上清液，再次离心去除细胞碎片，得到第二上清液；

(2)通过0.22μm滤膜对第二上清液进行过滤，去除细菌和残留细胞器，得到外泌体初步滤液；

(3)将步骤(2)中的外泌体初步滤液进行低速超滤离心，得到浓缩液1，加入PBS溶液洗涤再次低速超滤离心，收集不能通过滤膜产物，为浓缩液2；

(4)将步骤(3)中的浓缩液2与聚乙二醇溶液混匀，4℃孵育过夜，得到反应液；

(5)将步骤(4)的反应液离心取沉淀，对沉淀再次离心，所得沉淀即为所述的外泌体；

所述的低速离心指转速为8000r/min以下，相对离心力为10 000×g以下的离心。

2.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

所述的低速超滤离心的是指将含有超滤膜的超滤管在离心机中进行离心。

3.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的低速超滤离心在30000Da NMWL超滤离心管的超滤膜上进行；

步骤(4)中所述的浓缩液2与聚乙二醇溶液按体积比1:1进行混合。

4.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的浓缩液2的终体积为200～500μL；

步骤(4)中所述的聚乙二醇溶液为浓度为16％(w/v)的聚乙二醇溶液。

5.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的神经细胞为小鼠皮层神经细胞和海马神经细胞；

步骤(1)中所述的培养的温度为36～38℃；

步骤(1)中所述的培养的环境为二氧化碳浓度4％～6％；

步骤(1)中所述的培养所用的培养基为含神经生长因子培养基；

步骤(1)中所述的离心的速度为200～350g；

步骤(3)中所述的加入PBS溶液洗涤再次低速超滤离心可重复多次。

6.根据权利要求5所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的神经细胞为神经细胞活力高，神经纤维生长良好的小鼠皮层神经细胞和海马神经细胞；

步骤(1)中所述的离心的速度为200g；

步骤(3)中所述的加入PBS溶液洗涤再次低速超滤离心的重复次数为3次。

7.根据权利要求5所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的培养的温度为37℃；所述培养的环境为二氧化碳浓度为5％；

步骤(1)中所述的培养所用的培养基为Gibico公司的含2％B27的Neurobasal培养基。

8.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的低速超滤离心、再次低速超滤离心的条件为3500～4000g，4℃，30min；

步骤(5)中的离心的条件为1500g，4℃，离心30min；再次离心的条件为1500g，4℃，离心10min；

步骤(4)中所述的聚乙二醇为PEG6000。

9.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的离心的温度为4℃，离心的时间为10min；

步骤(1)中所述的再次离心的条件为2000～2500g，4℃，离心20min；

步骤(2)中所述的滤膜为混合纤维素滤膜；

步骤(3)中所述的PBS为1×PBS。

10.根据权利要求1所述的基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，其特征在于：

所述的外泌体置于-80℃下保存；

所述的方法中，每次离心、过滤或低速超滤离心后，将液体转移至新的容器，再进行下一步操作。