[发明专利]一种用于BRAF基因V600E突变检测的核酸序列及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测BRAF基因V600E突变的核酸序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明提供的检测BRAF的引物及探针能特异地扩增并检测BRAF V600E基因突变。本发明还公开了一种基于微滴式数字PCR系统的检测BRAF V600E基因突变的检测试剂盒，能实现快速、灵敏、准确的检测BRAF基因的突变。本发明具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床BRAFV600E基因突变的快速检测，为临床BRAF V600E突变的的诊断和治疗提供参考依据。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于BRAF V600E基因突变检测的核苷酸序列及其应用。

背景技术

BRAF基因是人类最重要的原癌基因之一,大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF绝大部分突变形式为BRAFV600E突变,主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活,对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要,是抗黑色素瘤等V600E突变肿瘤的有效作用靶标之一

BRAF是在佳学基因的肿瘤用药指导中是一个影响肿瘤药物使用效果的基因，目前已发现一类BRAF V600E抑制剂,对BRAF尤其是BRAF V600E有很高的抑制活性,代表为威罗菲尼(vemurafenib,PLX4032)和GSK2118436(dabrafenib),于2011年,被FDA批准上市。威罗菲尼对BRAFV600E突变的黑色素瘤患者具有明显的临床效果,用于治疗BRAFV600E突变的晚期黑色素瘤患者,有效延长了患者无进展生存期及总生存期,取得了突破性的治疗效果,也是典型的基于基因诊断选择用药的靶向治疗药物。但是耐药性的出现使得药物治疗效果受到限制,其耐药机制、新药物开发以及预防或延缓耐药的研究成为目前需要解决的关键问题。

目前，在精准医学的大背景下,液体活检作为一种便捷、微创、能够动态反映肿瘤基因谱全貌的方法在癌症临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用。血浆游离DNA(cfDNA)作为液体活检的主要表现形式，其含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，那么开发一种能够真正满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术就尤其重要。

微滴式数字PCR方法学由于其高灵敏度的优势，通过单分子的扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早起诊断和疗效监控。数字PCR技术在单分子扩增后对样品DNA精准定量，具有比其他PCR更高的测量精度。但是在检测稀有突变时，最大的困难在于对TaqMan探针的设计有着非常高的要求，主要由于突变型与野生型经常只存在1-2个碱基差异，Tm值差异较小，容易产生非特异性扩增。本发明从数字PCR检测体系对探针进行改进，采用LNA探针，其突出特点在于即使一个碱基错配，也能有效增加探针Tm值差异，提高亲和性和专一性，进一步提高数字PCR检测的稳定性、特异度和灵敏度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的新型BRAF V600E基因突变检测试剂盒，满足临床BRAF V600E诊疗需求。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测BRAF基因突变的的核酸序列，包括如下引物对及探针：

(1)扩增BRAF基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)扩增BRAF野生型基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；