[发明专利]一种发酵生产β-法尼烯的玉米水解液培养基及其应用

权利要求书

1.一种发酵生产β-法尼烯的玉米水解液培养基在发酵生产β-法尼烯中的应用，其特征在于：将生产β-法尼烯的菌株接种到一级种子培养基，培养后获得二级种子，将所得二级种子接种到发酵生产β-法尼烯的玉米水解液培养基中进行发酵得到β-法尼烯；

其中，所述生产β-法尼烯的菌株为合成β-法尼烯的基因工程菌，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了自身的内源基因GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了β-法尼烯合成酶基因AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和tHMG1基因，所需的启动子和终止子分别为P_GAL1，P_GAL10，P_GAL4和T_CYC1，T_ADH1；

发酵生产β-法尼烯的玉米水解液培养基的制备方法为：称取1500 g玉米醪加入60-70℃的水4500 mL，搅拌均匀后放置糊化20-120 min；加入0.9 mL、3万U/mL的耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后在85-90℃下液化1.5 h；液化完成后，迅速冷却至60℃，加入3 mL、10万U/mL的糖化酶，搅拌均匀后在55-60℃糖化20h；糖化完成后，用滤布过滤，得到澄清溶液，pH自然，105℃灭菌10 min，添加灭菌的缓冲液调节pH值为6.0，添加灭菌的微量元素母液，混合均匀，即得到所述发酵生产β-法尼烯的玉米水解液培养基；以上各组分的取用量为每1500g玉米醪对应的各组分的用量；

所述微量元素母液中含有5.75 g/L七水硫酸锌，0.32 g/L四水氯化锰，0.32 g/L无水硫酸铜，0.47 g/L六水氯化钴，0.48 g/L二水钼酸钠，2.9g/L二水氯化钙，2.8g/L七水硫酸亚铁，添加体积为原体系体积的1％；

所述酵母菌为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，基因型为：CEN.PK2-1C，MATa;ura3-52; trp1-289; leu2-3_112; his3Δ1; MAL2-8c; SUC2；所述法尼烯合成酶基因AaFS是经过密码子优化的，原始法尼烯合成酶基因AaFS来自Artemisiaannua，GenBank登录号为AAX39387.1，优化后的法尼烯合成酶基因AaFS的序列见SEQ ID NO.1，所述β-法尼烯合成酶基因AaFS整合在所述出发菌株酵母菌染色体GAL80位点，启动子和终止子分别为P_GAL10和T_CYC1；所述LmPK基因来自Leuconostoc mesenteroides，NCBI accession number YP_819405.1，所述LmPK基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD6位点，启动子和终止子分别为P_GAL10和T_CYC1；所述CkPTA基因来自Clostridium kluyveri，NCBI accession numberYP_001394780.1，所述CkPTA基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD6位点，启动子和终止子分别为P_GAL1和T_ADH1；所述DzeutE基因来自Dickeya zeae，NCBI accession number WP_012768716.1，所述DzeutE基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD4位点，启动子和终止子分别为P_GAL1和T_ADH1；所述SpHMGR基因来自Silicibacter pomeroyi，NCBI accessionnumber YP_164994，所述SpHMGR基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD4位点，启动子和终止子分别为P_GAL1和T_ADH1；所述GAL4基因为所述出发菌株酵母菌的内源基因，GenBank登录号为AQN77051.1，所述GAL4基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体RHR2位点，启动子为P_GAL4，终止子为其自身终止子；所述tHMG1基因为所述出发菌株酵母菌的内源基因，GenBank登录号为CAA86503.1，所述tHMG1基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体RHR2位点，启动子为P_GAL1，终止子为其自身终止子。