[发明专利]一种黄瓜绿斑驳花叶病毒诱导的基因沉默载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组和外壳蛋白亚基因组启动子信息选择合适的多克隆位点；

（2）基于黄瓜绿斑驳花叶病毒的全长侵染性克隆构建含BamHI酶切位点的载体，并命名为CGMMV-BamHI；

（3）扩增PDS基因片段，分别获得69bp、150bp、213bp 和300bp长度的PDS基因片段，还包括：从葫芦科植物叶组织中提取总RNA，然后使用Oligo dT引物、PrimeScript II逆转录酶进行反转录合成用于RT-PCR的第一链cDNA，以葫芦科植物cDNA为模板，使用引物进行PCR扩增；所述引物序列如下：

78-69P-X:GAGTGGATGAGACTCTTGCACAGTTAAATTATCTTGAGCCTCCAGTTATAGGTCTAGGTC；

78-69P-S:GAGTCTCATCCACTCTTGCACAGTTAAATTATCTTGAGCCTCCATTAAGTAAAGTCCTG；

78-213-F:CCCGTCAGGACTTTACTTAATGGATCCATGCTTACTTGGCCAGAG；

78-213-R:CGACCTAGACCTATAACTGGATCCAATGCATTGCATAGAAAGTTC；

78-150-F:cccGTCAGGACTTTACTTAATGGATCCGGATATGGGCTATTTTAAGGA；

78-150-R: CGACCTAGACCTATAACTGGATCCCCCGACTTCTCATCCACT；

78-300-F:CCCGTCAGGACTTTACTTAATGGATCCTTTGGGGCTTATCCCAA；

78-300-R: CGACCTAGACCTATAACTGGATCCTCTCATCCACTCTTGC；

（4）将上述扩增的PDS基因片段连入线性化载体CGMMV-BamHI中，分别形成重组载体CGMMV-BamHI-PDS69、CGMMV-BamHI-PDS150、 CGMMV-BamHI-PDS213 和CGMMV-BamHI-PDS300。

2.一种利用权利要求1所述的构建方法得到的黄瓜绿斑驳花叶病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于，包括重组载体CGMMV-BamHI-PDS69、CGMMV-BamHI-PDS150、CGMMV-BamHI-PDS213或CGMMV-BamHI-PDS300。

3.根据权利要求2所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒诱导的基因沉默载体的应用，其特征在于，包括：

（1）将重组载体CGMMV-BamHI-PDS69、CGMMV-BamHI-PDS150、 CGMMV-BamHI-PDS213 和CGMMV-BamHI-PDS300分别接种到葫芦科作物西瓜、甜瓜、黄瓜和瓠瓜上；

（2）观察记录每个载体使PDS基因沉默造成的表型，测量分析沉默效率，检测载体的稳定性。

4.根据权利要求3所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒诱导的基因沉默载体的应用，其特征在于，葫芦科作物接种时期分别为：西瓜、甜瓜和瓠瓜选择两片子叶、一片真叶期，黄瓜选择两片子叶两片真叶期。