[发明专利]示踪猪GADD45a亚细胞定位的方法及用途

权利要求书

1.一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1)、根据pEGFP-N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP-N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；

2)、GADD45a荧光示踪表达载体的构建：将利用含有载体末端15-25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP-N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：

引物Ⅰ为：

GADD45a-F：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGGC

GADD45a-R：TCACCGTTCAGGAAGATTAATCACTG

引物Ⅱ为：

XhoI-GADD45a-F：ctaccggactcagatctcgagccaccATGACTTTGGAGGAATTCTCGG

XhoI-GADD45a-R：aattcgaagcttgagctcgagCCGTTCAGGAAGATTAATCACTGG。

3.根据权利要求2所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：

所述步骤2)为：将pEGFP-N1质粒进行XhoI酶切线性化后，使用Trelief^TMSoSoo CloningKit Ver.2试剂盒与含有同源臂的GADD45a基因引物PCR扩增产物进行同源重组，并采用热激转化大肠杆菌，得到pEGFP-GADD45a的重组质粒。

4.根据权利要求1～3任一所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：将步骤2)所得的表达载体进行鉴定：

通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为GADD45a全长引物；测序引物为CMV-F和PEGFP-N3引物，分别为5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’和5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’。

5.如权利要求1～4任一所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的用途，其特征是：用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：用于研究猪GADD45a在不同细胞种类中的亚细胞定位。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征是包括以下步骤：

(1)、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；

(2)、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞、IPEC-J2等细胞，37℃，5％的CO₂中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；

(3)、转染48h后，分析GADD45a表达情况及其亚细胞定位，研究其亚细胞定位和功能调控。