[发明专利]一种用于检测TSPYL5基因甲基化的荧光定量PCR的方法

说明书

本发明涉及一种用于检测TSPYL5基因甲基化的荧光定量PCR的方法，具体操作方法包括如下步骤：第一步，提取待测样本基因组DNA，将待测样本基因DNA置于甲基化检测区Ⅰ；第二步，使用甲基化敏感性限制性内切酶HapaⅡ对检测区Ⅰ内待测样本基因组DNA进行酶切；第三步，使用引物对A对酶切产物进行荧光定量PCR扩增；第四步，对PCR产物的Ct值进行分析；第五步，根据分析Ct值得判断结果，判断样本中TSPYL5基因的甲基化水平程度。

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种用于检测TSPYL5基因甲基化的荧光定量PCR的方法。

背景技术

近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。甲基化DNA是在DNA链上修饰有一个甲基。人类异常的DNA甲基化多发生在基因的转录调控区，引起相应基因转录的关闭，DNA甲基化如同开关，调控着许多肿瘤相关基因的表达，在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断。

目前，对甲基化DNA的检测，通常根据甲基化敏感性限制性内切酶的特性，然后进行PCR扩增得到的PCR产物，DNA片段若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。但在PCR过程中引物的设计选取、引物的质量、引物的浓度，会影响PCR失败或扩增不理想。

本试剂盒拟建立基于不同敏感性限制性内切酶(MS-RE)切点在于不同位点作用时，对相应限制性内切酶的阻断或切割效率的影响的情况来检测甲基化水平程度，选用的限制性内切酶HpaII和MspI进行检验，这两种限制性内切酶分别对CpG甲基化位点的敏感程度完全不同，而且HpaII和MspI 是一组同裂酶两者均识别切割同样的序列-CCGG-位点，从而可以检测本检测方法采用的引物是否正确，从而保证了检测出DNA甲基化程度的可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测度高、准确率高的检测肝癌风险基因 TSPYL5甲基化水平的试剂盒，通过增加对应检测的基因组保证了测试的准确性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于检测TSPYL5基因甲基化的荧光定量PCR的方法，具体操作方法包括如下步骤：

第一步，提取待测样本基因组DNA，将待测样本基因DNA置于甲基化检测区Ⅰ。

第二步，使用甲基化敏感性限制性内切酶HapaⅡ对检测区Ⅰ内待测样本基因组DNA进行酶切；

第三步，使用引物对A对酶切产物进行荧光定量PCR扩增；

第四步，对PCR产物的Ct值进行分析；

第五步，根据分析Ct值得判断结果，判断样本中TSPYL5基因的甲基化水平程度。

其中，步骤三中的引物对A优选为以下三对引物中的一对；

AF1：5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’，

AR1：5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’；

AF2：5’-GTAGGCGTGTACGGTGGGAG-3’，

AR2：5’-AACGCACACCGGCCTTATTC-3’；

AF3：5’-GCATGATGACCACCGATATG-3’，

AR3：5’-AATCTCGCCGGATCCTAACT-3’；