[发明专利]一种利用细胞工厂制备临床级脐带间充质干细胞的工艺

说明书

本发明公开了一种利用细胞工厂制备临床级脐带间充质干细胞的工艺，所述方法包括如下步骤：步骤(1)、细胞接种：在干细胞种子库中取1支装干细胞，将其复苏后接种到1个2层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；步骤(2)、细胞工厂制备干细胞：待细胞融合度达90～95％时，将2层细胞工厂的干细胞消化下来，接种到1个10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；步骤(3)、干细胞产品制备：待10层细胞工厂中细胞融合度达到90～95％时，将干细胞消化下来，得到大量的干细胞。本发明可以规模化培养干细胞，生产的干细胞不仅仅细胞产量大、工艺稳定、产品质量易控制，而且可以节约人员开支、厂房建设，是未来产业化的方向。

技术领域

本发明属于生物研究技术领域，涉及一种脐带间充质干细胞的制备工艺，特别涉及一种利用细胞工厂制备临床级脐带间充质干细胞的工艺。

背景技术

细胞工厂(Cell Factory)是一种设计精巧的细胞培养装置，其材质为符合《美国药典》规定的聚苯乙烯材料，培养表面经亲水处理提高了细胞的吸附性，确保细胞贴壁更均一、更稳定，在大规模培养中更容易操作，更符合GMP的要求，且由于其工艺操作的精简化，大大降低了培养过程细胞的污染风险，增强了污染的可控性。在生产过程中，细胞工厂可以在有限的空间内最大限度利用培养表面，节约培养箱使用面积(一个10层细胞工厂的培养面积＝36.2个T175培养瓶的培养面积，而一个培养箱可放置4个10层细胞工厂，或者50个T175培养瓶，即使用细胞工厂可减少培养箱的使用面积一半以上)，无需进行任何厂房改造即可实现扩大产能的目的。如果与细胞工厂自动化操作设备结合使用，可全面实现细胞培养自动化，从而大大降低劳动强度和密集度，快速替代传统的细胞瓶培养技术，实现大规模细胞培养，增强对生产环境的质量可控性，同时能够降低批间差异。

人脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。hUC-MSCs形态、免疫表型以及多向分化潜能等多种生物学特性与骨髓MSCs极为相似，并且hUC-MSCs表达SSEA4、Oct-4、Nanog和Sox-2等胚胎干细胞标志物，可能是一群更为原始的干细胞。此外，hUC-MSCs还有取材方便、安全无病毒感染风险；脐带内含量高，细胞增殖能力稳定，可在短时间内大量扩增，易于工业化制备；不表达/低表达HLA-I类分子、不表达HLA-II类分子及共刺激分子，因此免疫原性极低，不易引起免疫排斥反应；回输体内后在组织局部微环境中能定向分化成多种组织细胞，具有安全性高和成瘤性低、不受伦理和法律限制等优势。外源性hUC-MSCs可作为种子细胞参与受损组织的再生修复；hUC-MSCs可分泌大量细胞因子，通过旁分泌作用调节受损组织细胞的修复，甚至促进受损组织本身的干细胞的增殖和活化；并且还具有免疫调节作用，能调节多种先天性或获得性免疫功能异常；同时具有趋化作用，可以阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，减轻组织损伤，有利于阻止炎症性疾病病情发展。hUC-MSCs的这些特性使其在再生医学行业和免疫性疾病的治疗上拥有广阔的前景。

随着以干细胞为主的细胞治疗研究的迅速发展，其在治疗退行性疾病、缺血性心脑血管疾病、肝硬化及糖尿病、自身免疫性疾病等领域已开展了多项临床试验研究，国内也建立了多家产业化基地，取得了突破性的成绩。国外已有多项干细胞注射剂获得药品批号，国内也有多家生物公司提交干细胞注射剂的新药申报，干细胞新药的产业化格局正在形成。在干细胞产业化的进程中，干细胞质量稳定性是质量控制的关键环节，要获得稳定质量的干细胞，干细胞的大规模批量生产的产量、生产工艺稳定性是前提条件。使用传统的T175培养瓶生产hUC-MSCs存在着产能低、人员能耗高、易污染、各瓶细胞间的差异大、稳定性不易控制、生产车间大、质控点多等问题。细胞工厂尤其是10层/40层的细胞工厂，一次培养可生产大量干细胞，不仅减少生产场地，同时也大大减少技术人员的操作环节，减少污染的可能性，并且一个细胞工厂生产的细胞可作为一个质量均一的产品，大大减少质控人员的工作量和工作成本，同时，细胞工厂与自动化设备结合将实现全自动化生产，是未来的产业化方向。

发明内容