[发明专利]检测猪流行性腹泻病毒的RPA-LED可视化试剂盒

说明书

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的RPA‑LED可视化试剂盒。本发明提供了检测猪流行性腹泻病毒的重组酶聚合酶等温扩增引物组，包括序列如SEQ ID NO：1‑3所示的上游引物、下游引物和探针。还提供了检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂，包括重组酶聚合酶、dNTPs和所述的引物组。另外提供了检测猪流行性腹泻病毒的逆转录重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，所述试剂盒含有所述的引物组或所述的试剂。本发明检测试剂盒的特异性强，灵敏度高，且结果便于观察，不需要复杂设备，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测猪流行性腹泻病毒。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的RPA-LED可视化试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性肠道传染病，主要临床特征为腹泻、呕吐和脱水，其临床症状、病理变化与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)极其相似难以区分。PEDV感染可发生于不同年龄段的猪，其中感染最严重的是仔猪，发病率和死亡率常达100％。PEDV在我国猪群中一直广泛传播，2010年10月，由于PEDV变异引发了PED在我国大规模的爆发，造成大量仔猪死亡，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒，在分类地位上隶属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)I群，与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcinerespiratory coronavirus，PRCoV)、人冠状病毒229E同属。PEDV粒子呈多形性，大多数呈球形，直径大小为95～190nm(平均直径约为130nm)囊膜上分布着长度为18～23nm的纤突，由内向外呈放射状排列。PEDV的基因组全长约为28kb，5’端非编码区(5’-untranslatedregion，UTR)有帽子结构，3’端有poly(A)尾巴和至少7个开放阅读框(ORF)，同时有编码S、E、N、M基因的4个结构蛋白和ORF1a、ORF1b以及ORF3基因的3个非结构蛋白。整个基因组从5’到3’的顺序依次为：5’-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’。Duarte等通过研究证实了PEDV各蛋白片段的大小，其中编码非结构蛋白的ORF(1a和1b)占到整个基因组的三分之二大小的长度，而编码基因组结构蛋白的S蛋白为150～220kDa、E蛋白为7kDa、M蛋白为20～30kDa、N蛋白为58kDa，ORF3是一种调节基因，编码一种辅助蛋白。

1971年英国首次报道PEDV，随后欧洲几个国家相继出现了类似的病毒性腹泻，1978年在比利时首次分离到PEDV并将其命名为CV777株。PED主要发生在冬、春寒冷季节，病猪和潜伏感染猪呕吐物和腹泻粪便中含有大量病毒为该病的主要传染源，可通过直接接触进行传播。当猪场发生PEDV感染时主要通过粪-口途径进行传播，不同年龄和品种的猪都能受到感染并表现不同程度的症状，但仔猪的病情尤其严重死亡率可高达100％。2000年以来，欧洲已少有爆发急性，但该疾病在包括中国、韩国和日本在内的亚洲国家中的流行却愈发的严重起来。

由于PED与TGE、轮状病毒病、大肠杆菌等肠道感染性疾病的相似性，尤其是PEDV与TGEV两种病毒，仅仅通过临床症状和病理变化几乎不能特异性区分，因此实验室诊断对于PEDV的确诊是十分必要的。