[发明专利]一种血清多肽组学的质谱检测方法

说明书

本发明提供了一种血清多肽组学的质谱检测方法，包括样本制备、数据非依赖性质谱采集及数据处理；该方法针对血清多肽组学样本发展了数据非依赖性质谱采集方法，通过对血清样本的预分析实验获取样本的母离子分布情况，由此确定最优的可变隔离窗口；通过对多肽组学样品制备方法、质谱采集方法和数据处理方法的优化，各步骤各条件相互配合，最终实现多肽检测数目、鉴定重现性和定量准确性的显著提高；本发明方法具有高通量、高重现性和高准确性的特点，适合于大规模临床血清样本的分析及疾病标志物的检测，具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种血清多肽组学的质谱检测方法。

背景技术

多肽组学是研究机体内源性多肽及低分子量蛋白质的成分、结构、功能以及变化规律的科学，被认为是连接蛋白质组学和代谢组学之间的桥梁。作为一门新兴的学科，近年来的研究表明内源性肽在作为药物本身、药物靶标以及疾病标志物等方面都有着巨大的潜力。血清作为一种重要的临床体液，蕴含着丰富的疾病标志物信息，小分子量的多肽可以自由的被分泌到细胞外的间隙里，穿透血管外膜，进入血液循环，对血清多肽组学的研究可以从新的角度来研究肿瘤，寻找肿瘤标志物，为肿瘤的早期诊断和预后以及动态监测提供重要的依据。

血清成分极度复杂，包含许多大分子蛋白及小分子代谢物。目前已知的22种高丰度蛋白约占血清蛋白总量的99％。与蛋白质相比，血清中多肽的含量极低，大量高丰度蛋白质很容易掩盖含量极低的多肽组信息，这增加了血清多肽组学检测的难度。除了发展高效的样品制备方法外，高灵敏和高通量的多肽检测方法一直是研究的热点和难点。质谱技术由于其高灵敏度、宽动态范围、易与各种分离技术联用等特点，已成为多肽组学的主流分析技术。早期的多肽组学研究通常采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)方法，通过检测肽质量图谱，比较差异峰来寻找疾病相关的差异肽，但是该方法在准确鉴定多肽序列及其肽段翻译后修饰研究方面存在不足，并且由于电离抑制效应导致检出的肽段数目较少。近年来，纳升液相色谱-电喷雾-串联质谱技术(nanoLC-ESI-MS/MS)被越来越多地用于多肽组学的研究，该方法通过结合纳升液相色谱的高效分离能力和串联质谱的多级检测功能，大大地提高了多肽组学检测的灵敏度和准确性，通过串联质谱技术得到的碎片谱图可以提供多肽的序列和修饰位点信息，为开展多肽组学的深入研究提供了可能。目前，数据依赖性采集方法(Data Dependent Acquisition，DDA)仍然是串联质谱非目标(Untargeted)化合物分析的主要手段。蛋白质组学的经典策略-鸟枪法(Shotgun)即基于DDA发展而来，DDA的采集方式如下：利用一级全扫描检测母离子，然后按信号强度排列，将前若干位的母离子依次选择、碎裂，并扫描二级碎片离子。近年来，DDA的方法不断发展，动态排除、价态排除、中性丢失/诊断离子触发等技术的开发，使DDA尽可能多地采集有效谱图，实现鉴定结果最大化，但其局限性也逐渐显现:(1)先强后弱的采集方式易造成低丰度组分信息的丢失；(2)母离子选择有一定的随机性，造成重现性不佳；(3)每个循环获得的谱图数量不一，造成扫描点数不均匀，影响定量分析准确性。由于多肽组学的研究对象是丰度极低的游离多肽，且需要在多肽水平上对数据进行比较，DDA方法的上述缺陷在多肽组学的研究中更加凸显，目前单针采集的覆盖度低、检测重现性及定量准确性差已成为限制多肽组学发展的瓶颈问题。因此，亟需发展一种新的质谱检测方法以解决上述问题。