[发明专利]非综合征性常染色体显性遗传性耳聋致病基因KCNQ4突变检测用试剂盒

说明书

本发明公开了一种非综合征性常染色体显性遗传性耳聋致病基因KCNQ4突变检测用试剂盒。试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，使用本发明所述试剂盒检测患者KCNQ4基因是否存在c.C1258T突变，从而诊断非综合征性常染色体显性遗传性耳聋的原因。该试剂盒将有利于临床上开展非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患者的KCNQ4突变筛查工作，为非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患者的诊断提供依据。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在诊断非综合征性常染色体显性遗传性耳聋DFNA2中应用的KCNQ4基因单个突变位点c.C1258T(p.R420W)分型检测试剂盒。

背景技术

KCNQ4基因是1999年由Kubisch等报道的一个钾通道基因，Van等通过家族染色体连锁分析，最终将导致DFNA2的基因定位于染色体1p34区段。随后发现钾离子通道家族的成员KCNQ4基因就位于染色体1p34区段，正是DFNA2的致病基因。在小鼠耳蜗中，Kharkovets等发现KCNQ4mRNA大量分布在外毛细胞中；通过KCNQ4特异抗体标记发现，KCNQ4蛋白主要位于外毛细胞的基底膜部分，在前庭器官中，KCNQ4局限分布于I型毛细胞和包裹感觉细胞的盏状传入神经末梢中，在中枢神经系统中，KCNQ4分布于听觉传导通路的(非全部)核团神经元中，如耳蜗核、外侧丘系以及下丘中，在大脑的其他区域没有发现KCNQ4的表达。KCNQ4是第一个被发现的仅存于单一感觉通路中的离子通道。因此，将其作为药物靶点进行耳聋治疗有很好的特异性。

KCNQ4是染色体1p34区域的一个长约1.25Mb的片段，其mRNA全长4116bp，含有14个外显子，编码695个氨基酸组成的多肽，分子量约为77kDa。典型的KCNQ4通道由4个亚基组成，每个亚基由6个跨膜片段(S1-S6)以及分布在膜内侧的N端和C端组成。S4片段包含了通道的电压感受区，S5、S6及位于它们之间的P-loop，形成孔区。4个P-loops组成了通道的离子选择器。所有的KCNQ4通道都有一个很长的C端，能够整合多条信号通路。KCNQ4基因在内耳仅表达在外毛细胞上，而不表达在内毛细胞和血管纹上，其功能主要是参与受刺激后毛细胞的钾离子循环。KCNQ4基因突变可引起表型为常染色体显性遗传的习语后高频听力损失为主的听力下降。

在一个法国DFNA2家庭的3个患者中，发现了位于KCNQ4基因的突变位点G285S。同年，在一个美国DFNA2家庭中也发现了KCNQ4基因同一个氨基酸位点的突变G285C。这两个突变都改变了K⁺通道的标志序列(GYG)的第一个甘氨酸(G)，而这个标志序列正是K⁺的选择性过滤器。G285S突变改变了位于通道孔区的一个氨基酸残基，该位点突变不仅抑制了突变型KCNQ4通道钾离子电流的产生，还能够抑制野生型KCNQ4通道钾离子电流的产生，引起一个显性负效应，从分子水平上解释了DFNA2的显性遗传机制。该标志序列(GYG)的第2个甘氨酸突变(G287R)也被发现是导致包含17个家庭成员耳聋的元凶。除了G285S、G285C和G287R外，KCNQ4通道孔区的另外9种错义突变也随后被报道。Kim及Gao等都曾报道，将孔区的5种突变L274H、W276S、L281S、G285C、G296S以及C端的突变G321S表达在异源的表达系统中，发现由于通道滞留在内质网中而无法产生有功能的通道。将野生型KCNQ4与突变体混合用于模拟临床上所见的DFNA2能够产生幅度很小的电流。除了通道孔区的突变外，在跨膜区也发现有KCNQ4的突变。在DFNA2患者中还发现了缺失突变和插入突变。

KCNQ4基因突变的发现，不仅会促进该病的发病机理等基础研究的发展，还将大大促进非综合征性常染色体显性遗传性耳聋的基因诊断和治疗的开展。通过产前诊断筛查及新生儿KCNQ4基因突变的普遍筛查，可以降低非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患儿的出生率，并且实现症前诊断，从而指导携带致病基因的患者定期复查，预防疾病的发生，这将会大大减少耳聋患者的数量，减轻社会压力。