[发明专利]一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用

说明书

本发明公开了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用，属于基因工程技术领域。其技术方案为：所述重组质粒是以pET‑28a（+）质粒为载体，在pET‑28a（+）限制性酶切位点BamHI和XhoI之间插入合成的Omp10‑Omp28‑L7/L12基因全长，建成含有Omp10‑Omp28‑L7/L12基因片段和卡那霉素筛选标签的pET‑28a（+）重组质粒，即pET‑28a（+）‑Omp10‑Omp28‑L7/L12重组质粒。本发明的有益效果为：本发明成功克隆布鲁氏菌Omp10‑Opm28‑L7/L12，并连接转化至表达质粒，实现了重组质粒在大肠杆菌表达系统的高效可溶性表达，表达的蛋白能在体液及细胞水平上抑制布鲁氏菌的感染、增殖和迁移能力，并可促进小鼠体内抗体的水平及延长免疫时间，为布鲁氏菌病的治疗提供新的治疗思路。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用。

背景技术

布鲁氏杆菌(brucella)属于布鲁菌，是革兰阴性的球杆菌，一种兼性胞内寄生革兰阴性小球杆菌，多数单个排列，极少数2个相连或呈短杆状，多寄生于网状内皮系统。菌体无鞭毛，不形成芽胞，但有毒菌株可带菲薄荚膜。

动物都可感染布鲁菌病，但以羊、猪、牛最为易感。人也可感染布鲁菌，以羊布鲁菌的感染力最强，危害最严重，其次是牛布鲁菌。主要通过消化道、呼吸道、生殖道及损伤的皮肤、粘膜和吸血昆虫感染，主要侵害生殖系统和淋巴系统、病程反复，目前无法治愈，不仅给畜牧业带来巨大的经济损失，还严重威胁着人类的健康。

国内外的研究工作已经发现并筛选了部分具有较好免疫原性的蛋白质作为布鲁氏菌诊断和亚单位疫苗的候选蛋白。目前，研究较多的分子有布鲁氏菌主要外膜蛋白，细菌表面蛋白BCSP31，胞质结合蛋白P39，铁结合蛋白BFR，二氧四氢蝶咙合成酶BLS，Cu-Zn超氧化物歧化酶Cu-Zn SOD，热休克蛋白GrOEL、GrOES，转运蛋白YajC，DNA修复蛋白UvrA，核蛋白L7/L12等。

Omp28是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白。有报道显示在牛、羊、山羊、和人类的布鲁氏菌感染中都可以检测到Omp28抗原的存在。使用Omp28作为检测抗原，准确率可以达到90％以上(SecO-Mediavilla P.etc，2003)。Omp10具有更好的保守效果，布鲁氏菌外膜蛋白Omp10，存在于所有已知的布鲁氏菌的种和生物型之中(ClOeckaert A，1999；TibOr A，1999)，被期待能应用于加强布鲁氏菌的血清学检测。L7/L12核蛋白重要的布鲁氏菌优势抗原，各菌株中具有高度的保守性，研究发现，从布鲁氏菌中提取的L7/L12蛋白能特异地刺激感染动物的单核细胞，并促进γ干扰素(γ-IFN)的转录和表达，起辅助免疫保护作用(S.C.Oliverira.Etc,1994)。

发明内容

将Omp10、Omp28和核蛋白L7/L12基因联合应用于布鲁氏菌的血清学检测，不仅可以提高检测的敏感性和准确性，也能够区分天然感染与疫苗接种反应,具有良好的应用前景。并且可以作为基因工程疫苗的候选抗原，构建亚单位疫苗，通过与佐剂相配合来免疫动物，诱导细胞和体液型免疫反应，从而产生保护力。为了实现上述发明目的，本发明提供了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用。