[发明专利]一种双链寡核苷酸核酸探针的结构和用途

说明书

本发明提供了一种双链寡核苷酸核酸探针的结构，使用方法及其在核酸荧光定性、定量分析、医学诊断和生命科学研究中的用途。双链寡核苷酸核酸探针是由两条完全或部分碱基互补的寡核苷酸链组成，每条寡核苷酸链的末端可以连接荧光基团或对应的荧光淬灭基团，两条寡核苷酸探针链均可与待测目的核酸序列杂交结合。本发明的双链寡核苷酸核酸探针荧光淬灭彻底，检测灵敏度高，不会发生非特异延伸形成引物二聚体，因此特异性强，可广泛用于病原体检测、耐药分析以及生命科学研究等核酸检测领域。

技术领域

本发明涉及一种生物检测技术工具，具体是一种双链寡核苷酸核酸探针及其使用方法和它在基因荧光定性、定量分析、医学诊断等生命科学研究中的应用，属于基因检测技术领域。

背景技术

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。因其准确、快速、灵敏等特点被国际公认为传染病相关病原微生物实验室确证的最有效手段之一，近年来该技术在SARS、甲流等新突发传染病的确证、常规病原体的检测中均发挥了不可替代的作用。

荧光PCR的化学原理可分为3个基本类型：DNA结合染料法、淬灭染料引物法和荧光探针法。前2种方法均可检出引物二聚体等非特异反应产物，特异性不强，因此在传染病的临床诊断中应用极少。在传染病的分子诊断中一般建议采用荧光探针法。荧光探针法依赖荧光共振能量迁移(FRET，Fluorescent Resonance Energy Transfer)实现检测，包括TaqMan探针、分子信标、蝎型(Scorpion)探针等。该法仅检测特异性扩增产物，因此特异性强。目前应用最广泛的为TaqMan探针技术，该技术主要利用了Taq酶的5’外切酶活性。首先合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5’端标记一种荧光分子，3’标记一种相应的荧光淬灭分子，3’端淬灭分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光。正常情况下该探针理论上不发出荧光，但当溶液中有PCR产物时，探针与PCR产物结合，激活Taq酶的5’端外切酶活性，将探针切割成单核苷酸，与此同时，标记在探针上的荧光基团游离出来，导致发出荧光，且切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应液中荧光信号强度即可计算出初始模板的浓度。TaqMan探针技术尽管应用广泛，但仍存在以下主要缺点，一是线性探针的长度限制了能量转移效率，淬灭难以彻底，导致本底较高；二是探针的水解依赖Taq酶的外切酶活性，定量时受酶性能及质量影响较大，酶活性差异给定量带来了较大的不确定性；三是TaqMan探针只标记一个荧光分子，灵敏度有待提高。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于针对TaqMan探针技术存在的不足，提供一种新的双链寡核苷酸核酸探针结构、使用方法及其在基因荧光定性、定量分析，医学诊断和生命科学研究等领域的应用。

本发明提供了一种双链寡核苷酸核酸探针结构，由两条完全或部分碱基互补的寡核苷酸链组成，两条所述寡核苷酸链均由6-50个寡核苷酸组成，每条所述寡核苷酸链的末端连接荧光基团或对应的荧光淬灭基团，两条寡核苷酸探针链均与待测目的DNA或者RNA核酸序列的部分片段按碱基配对原理杂交结合。

本发明通过提供一种新的双链寡核苷酸核酸探针技术，此技术的双链探针互为彼此的荧光探针和淬灭探针，荧光基团和淬灭基团距离更近，淬灭更彻底，大大降低了荧光本底；不完全依赖外切酶活性；可标记两个或多个荧光分子，两条探针都与模板结合，提高了检测灵敏度，因此该技术在很大程度上克服了现有技术的不足，通过对探针结构的重新设计，扩大了探针本身的应用范围。

优选地，作为进一步可实施的方案，荧光或淬灭基团连接在一条链的5’或者3’末端，当一条链的5’或者3’末端标记荧光基团，与其结合的对应另一条链的3’或者5’则需标记相应的荧光淬灭基团，使淬灭基团能够最大限度的接近荧光基团；或一条链两末端都标记荧光基团，对应的另一条链两末端都标记淬灭基团。