[发明专利]同步检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及试剂盒

权利要求书

1.一组用于同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类成分的多重液相基因芯片的引物及探针，其特征在于，由禽类、鱼类、反刍类中各类别的通用上游引物、通用下游引物和通用探针组成，其中，所述禽类的通用上游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其通用下游引物序列如SEQ ID No.3所示，通用探针如SEQ ID No.4所示；

所述鱼类的通用上游引物序列如SEQ ID No.5所示，其通用下游引物序列如SEQ IDNo.6所示，通用探针如SEQ ID No.7；

所述反刍类的通用上游引物序列如SEQ ID No.8所示，其通用下游引物序列如SEQ IDNo.9所示，通用探针如SEQ ID No.10所示；其中，SEQ ID No.10中的R表示简并碱基，代表G或A；

所有下游引物的5’端标记生物素，所有探针的5’端C12标记氨基。

2.一种用于同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的禽类、鱼类、反刍类的各类别通用上游引物、通用下游引物和通用探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中，所述2×PCR缓冲液中包括：浓度为40mmol/L、pH8.0的Tris-HCl，8mmol/L的MgCl₂，400μmol/L的dNTP，300mmol/L的KCl，1mg/mL的BSA和体积浓度为6％的甘油。

4.一种用于同步检测禽类、鱼类、反刍类三大类物种成分的多重液相基因芯片的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、提取待检样品中的核酸；

S2、利用如权利要求1所述的用于检测鉴定禽类、鱼类、反刍类三大类成分的液相基因芯片的通用上游引物、通用下游引物对上述步骤S1提取的待检样品中的核酸进行不对称PCR扩增，获得PCR扩增产物；

S3、利用分别偶联有如上所述禽类、鱼类、反刍类的通用探针的聚苯乙烯乳胶微球，与步骤S2获得的扩增产物进行杂交反应；

S4、用液相芯片仪检测步骤S3杂交反应后的信号值即MFI值，根据检测的本底值，判定检测结果；

其中，所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤S2、步骤S3的反应，其中在所述空白对照，用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的测得的MFI值的平均值，作为本底值；

结果判定：当被检样品的MFI值大于5倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的扩增体系，包括禽类、鱼类、反刍类的各类别通用上游引物、通用下游引物、PCR缓冲液、DNA聚合酶、待检样品模板和水；其中，禽类的通用上游引物SEQ ID No.1终浓度为20nmol/L，SEQ ID No.2的终浓度为50nmol/L，禽类的通用下游引物的终浓度为120nmol/L；鱼类的通用上游引物的终浓度为50nmol/L，其通用下游引物终浓度为120nmol/L；反刍类的通用上游引物终浓度为50nmol/L，其通用下游引物终浓度为120nmol/L。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的扩增反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，58℃退火8秒，72℃延伸2秒，共进行35个循环；最后72℃延伸1分钟；4℃停留。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述杂交反应包括：

S301、将禽类、鱼类、反刍类的通用探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；

S302、将步骤S2获得的扩增产物与上述步骤S301中偶联聚苯乙烯乳胶微球的探针进行杂交反应；

S303、杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白进行温育，

S304、取步骤S303获得的溶液进行检测MFI值。