[发明专利]一种低起始量PCR-free高通量测序文库的构建方法在审
| 申请号： | 201811644479.7 | 申请日： | 2018-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN109609597A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 孙广欣;王冬;王建伟;伍启熹;刘倩;刘珂弟;唐宇 | 申请（专利权）人： | 北京优迅医学检验实验室有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;陈征 |
| 地址： | 100195 北京市海淀区*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 测序文库 末端修复 构建 磁珠纯化 高通量 起始量 生物信息学领域 高通量测序 接头连接 末端磷酸 文库构建 起始DNA 测序 碱基 建库 无创 整合 血浆 耗时 回收 诊断 应用 研究 | ||
1.一种低起始量PCR-free高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取血浆中cfDNA，对其进行末端修复和5’末端磷酸化，纯化回收末端修复产物；
(2)对纯化后的末端修复产物，3’末端加“A”碱基和接头连接体系整合在一个体系中先后进行反应；
(3)纯化接头产物，获得测序文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的血浆中cfDNA量≥1ng。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的末端修复和5’末端磷酸化的反应体系为：
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的反应条件为：20℃-37℃10-30min。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)选用相对于反应产物，用1.5-2.5倍体积的磁珠进行纯化。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，3’末端加“A”碱基反应体系为：
10×反应缓冲液 1/10稀释后使用
dATP 0.2-1mM
Klenow exo-(3’→5’) 0.2-1.0u/μL。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，接头连接的反应体系为：
2×连接缓冲液 1/2稀释后使用
分子接头 0.005-0.05μM
T4DNA连接酶 10-50u/μL。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的3’末端加“A”碱基的反应条件为20℃～37℃，反应10min～30min；
接头连接的反应条件为：20℃～37℃，反应10min～20min；60℃～75℃，反应10min～20min。
9.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)的纯化接头产物采用磁珠纯化，磁珠用量是接头产物0.3-0.8倍体积。
10.权利要求1-8任一所述的构建方法在低起始量DNA高通量测序中的应用。
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