[发明专利]用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂，其特征在于，包括：1μg/μL～5μg/μLCarrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、1μg/μL～5μg/μL糖原、0～5μg/μL线性丙烯酰胺、1μg/μL～5μg/μL酵母tRNA、2μg/μL～10μg/μL大马哈鱼精子DNA和/或鲱鱼精子DNA和水；所述多聚腺苷酸的残基数为2100～10000nt，所述线性丙烯酰胺的重均分子量为100万～500万；所述Carrier RNA、所述多聚腺苷酸、所述糖原、所述线性丙烯酰胺、所述酵母tRNA、所述大马哈鱼精子DNA和所述鲱鱼精子DNA的质量比例为1:1:1:1:1:1:1。

2.一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磁珠悬浮液、SDS溶液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液包含45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10～30mol/L异硫氰酸胍、2～4mol/L醋酸钾和5wt～10％吐温20，pH值为7.6。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述SDS溶液浓度为10％。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶溶解缓冲液包含45～75mmol/L Tris-HCl和100～120mmol/LNaCl。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液包含45～75mmol/LTris-HCl、100～120mmol/LNaCl、30～60mmol/L乙二胺四乙酸二钠和1.5wt％曲拉通，pH值为8.0。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二洗涤液包含80％的乙醇。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无核酸酶水。

10.一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，采用如权利要求2至9中任一项所述的试剂盒进行提取外周血中游离循环肿瘤DNA。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)预先将1mg蛋白酶K预先溶于500～1000μL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入15μL所述蛋白酶K溶液和50μLSDS溶液；

2)转移1mL血清或血浆样品至含15μL所述蛋白酶K溶液和50μL所述SDS溶液所述离心管中；

3)置于水浴锅里60℃孵育10min，每隔5min涡旋混匀1次；冰上放置5min；

4)加入15μL磁珠悬浮液、1250μL裂解结合液至所述离心管中，涡旋混匀30秒，再加入2μL增强剂，室温颠倒混匀15分钟；

5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

6)加入500μL第一洗涤液，涡旋混匀30秒；

7)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

8)加入500μL第二洗涤液，涡旋混匀30秒；

9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

10)重复步骤8)和9)一次；

11)离心，收集管所述离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；

12)空气干燥3～5分钟；

13)加52μL的洗脱液，涡旋打散磁珠，室温放置5～10分钟，期间震荡2～3次加速DNA溶解；

13)转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，所述溶解的DNA即为游离循环肿瘤DNA。