[发明专利]核酸助沉剂、孕妇血浆游离DNA提取试剂盒及方法

权利要求书

1.一种孕妇血浆游离DNA提取方法，其特征在于，采用孕妇血浆游离DNA提取试剂盒进行孕妇血浆游离DNA提取；

孕妇血浆游离DNA提取试剂盒包括核酸助沉剂、磁珠悬浮液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液；

所述核酸助沉剂包含：0.5μg/μL ~1μg/μL Carrier RNA、1μg/μL~5μg/μL多聚腺苷酸、2~5μg/μL糖原、0.2~0.5mol/L醋酸钠、1~2μg/μL线性丙烯酰胺和H₂O；所述多聚腺苷酸的残基数为2100~10000nt，所述线性丙烯酰胺的重均分子量为100万~500万；

所述裂解结合液包含1%~10%的十二烷基硫酸钠、2~5mol/L的异硫氰酸胍、40~80 mmol/L pH=7.5的Tris-HCl、1~10 mmol/L pH=7.5的EDTA、体积百分比为0.5~7%的Trition X-100、0.1~1 mol/L的NaCl；

所述蛋白酶溶解缓冲液包含40~70 mmol/L Tris-HCl和8~12 mmol/LCaCl₂；

所述第一漂洗液包含100~500 mmol/L的Tris-HCl、50~80mmol/LEDTA、2~5mol/L异硫氰酸胍和体积百分比为40~65%的乙醇，所述第一漂洗液pH=8.0；

所述第二漂洗液包含5~20 mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为80~85%的乙醇，所述第二漂洗液pH=8.0；

所述洗脱液包含10~20mmol/L的Tris-HCl或纯化水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）预先将180 mg 蛋白酶K预先溶于9 mL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入35~45μL所述蛋白酶 K溶液和35~45μL 磁珠悬浮液；

2）转移600μL血浆样品至含所述离心管中；

3）加入800~1000μL 裂解结合液至所述离心管中，涡旋混匀15秒；

4）加入1μL核酸助沉剂，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟；

5）转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

6）加入500~600μL 第一漂洗液，涡旋混匀15秒；

7）转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

8）加入500~600μL 第二漂洗液，涡旋混匀15秒；

9）转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

10）重复步骤8）和9）一次；

11）离心，收集管所述离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；

12）空气干燥10分钟；

13）加30~40μL的洗脱液或纯化水，涡旋打散磁珠，室温放置5~10分钟，期间旋涡震荡2~3次加速DNA溶解；

14）转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，所述溶解的DNA即为孕妇血浆游离DNA。