[发明专利]一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法

说明书

本发明公开了一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法；旨在提供特异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测锦鲤疱疹病毒检测引物和方法；其技术方案包括引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：3所示的引物；检测方法为：1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；2)以抽提的样本DNA为模板，使用权利要1所述的引物组，权利要求2探针配制RPA反应体系，采用TwistAmp exo试剂盒进RPA扩增反应；3)将RPA扩增后的反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有KHV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有KHV；本发明属于动物的病原检测领域。

技术领域

本发明属于动物的病原检测领域，具体涉及快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法。

背景技术

锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koiherpes virus disease，KHV)引起的一种高度传染性的病毒性疾病，威胁着鲤鱼和锦鲤的繁殖。锦鲤疱疹病毒又叫鲤科疱疹病毒3型(cyprinidherpesvirus 3，CyHV-3)，属于属疱疹病毒科，病毒有囊膜，核衣壳为二十面体，直径170～230nm，该病毒由31种病毒多肽组成，病毒核酸为双链DNA，基因组大小约为227kb。所有鲤鱼和锦鲤的年龄组都易受KHV感染，并且表现出高发病率和死亡率。

锦鲤疱疹病毒多发于春秋季节，潜伏期2周左右，出现症状后24-48h内会出现死亡现象，死亡率高达80％-100％。由于其对鲤鱼和锦鲤行业的传染性和重大经济损失，KHVD被世界动物卫生组织列为可通报的疾病，我国将其列为二类动物疫病。KHVD的临床症状通常是非特异性的，包括皮肤苍白或变色，眼球内陷，皮肤和鳍底部出血，鳃变色和坏死，严重威胁水产养殖业的经济情况。锦鲤疱疹病毒于1997年在以色列首次被发现，先后在世界十几个国家和地区传播与流行，目前为止，已经在亚洲、欧洲和北美洲等多个国家发现。像其它疱疹病毒一样，潜在的KHV感染可以被压力因子激活。

KHV已知可以用细胞中分离出来，但因其操作复杂，细胞病变难以判断，加上难以处理，因此，病毒分离不被认为是KHVD的最佳诊断方法。KHVD的诊断依赖于基于病毒DNA的检测方法，其比病毒分离或免疫诊断测定法更敏感，其中已经开发并验证了各种终点PCR，巢式PCR和实时荧光PCR测定以检测KHV。此外，还开发了不同的等温扩增测定法。核酸扩增试验被认为是许多传染病诊断的标准。这些技术比基于抗体的测试具有更高的灵敏度和特异性，并且比基于培养的测试更快地产生结果。PCR是最古老的和用于核酸扩增的黄金标准技术。然而，尽管有其优点，但PCR技术需要昂贵的仪器，在靶序列扩增过程中需要循环变性、退火的步骤，往往需要几个小时才能产生结果。

因此，有研究人员已经开发了不同的等温核酸扩增方法，并且这些方法在灵敏度，特异性和通量方面可以满足或超过基于PCR的方法。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前景的等温核酸扩增技术，它依赖于重组酶，单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的结合，在37到42℃的恒定温度下进行20-30min的DNA扩增。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，ssDNA结合蛋白稳定非模板链的置换，并用链置换聚合酶进行启动互补DNA链合成。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内，目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式:RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合 (基础型RPA)、RPA与荧光检测技术相结合(real time RPA)、RPA与侧向流动免疫技术相结合(RPA-LFD)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测锦鲤疱疹病毒检测用引物和探针。

本发明的另一目的在于提供快速检测锦鲤疱疹病毒检测方法。

为此，本发明提供的第一个技术方案为：