[发明专利]一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法

说明书

本发明属于蛋白质分析技术领域，具体为一种高通量简易细胞O‑糖基化位点的富集、鉴定方法。本发明方法包括：通过在细胞培养环境中加入O‑GalNAc糖链合成抑制剂，使O‑GalNAc糖链合成抑制在单个GalNAc的水平；然后通过超滤辅助凝集素富集技术实现O‑GalNAc糖肽的富集，利用单糖竞争机制释放富集到的O‑糖肽；最后通过LC‑MS，高通量鉴定O‑GalNAc糖基化位点。本发明解决了因为O‑糖链释放酶的缺失和无保守的修饰位点序列等原因带来的O‑GalNAc位点高通量鉴定困难的问题，通过抑制剂简化O‑糖链策略、超滤辅助凝集素亲和富集技术，实现了O‑GalNAc位点的大规模鉴定。

技术领域

本发明属于蛋白质分析技术领域，具体涉及一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法。

背景技术

糖基化是蛋白质修饰中最普遍的后修饰。目前N-糖基化修饰的分析技术日趋成熟，但O-糖基化修饰，特别是在O-GalNAc（O-乙酰半乳糖胺）修饰的分析仍有很大的瓶颈。高效特异的O-糖链释放酶的缺失和非保守的修饰位点序列特征（比如N糖的NXS/T motif）使得O-GalNAc位点研究不能直接沿用N-糖基化现有的技术。与此同时，糖链的自身高分子量、糖苷键易断裂等的特性导致O-GalNAc质谱谱图搜库不能和乙酰化、磷酸化以及O-GlcNAc等修饰那样通过在搜库过程中设置固定分子量修饰来实现。这些都限制了O-GalNAc糖基化修饰位点的大规模鉴定。近年来Clausen等人发展的简单细胞(Simple cell)策略基因手段敲除O-糖起始延长酶的伴侣蛋白COSMC，简化了O-GalNAc的糖链结构，使细胞产生的的O-GalNAc的糖链都简化为只有一个单糖O-GalNAc的形式，再进行鉴定，由此获得了当前最大的O-GalNAc位点数据集。然而，该方法需要稳定敲除伴侣蛋白基因，从实验操作技术难度高，在一定程度上限制了该方法的应用和推广。因此，本发明采用一种“化学简化细胞策略”实现O-糖基化位点的大规模富集和鉴定，该方法具体通过抑制剂将O-GalNAc糖链合成抑制在单个GalNAc的水平，进一步结合超滤辅助凝集素亲和富集实现O-GalNAc的高通量富集，随后通过液质联用质谱的分析，实现高通量高效的O-糖基化位点鉴定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、易操作、快速高效的高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法。

本发明提供的高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法，具体步骤如下：

（1）通过在细胞培养环境中加入O-GalNAc糖链合成抑制剂，使O-GalNAc糖链合成抑制在单个GalNAc的水平；

（2）然后通过超滤辅助凝集素富集技术实现O-GalNAc糖肽的富集，利用单糖竞争机制释放富集到的O-糖肽；

（3）最后通过LC-MS，高通量鉴定O-GalNAc糖基化位点。

本发明提供的高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法，进一步的具体操作流程如下：

（1）将O-糖链合成抑制剂加入细胞培养基中；

（2）细胞在含抑制剂的培养基中培养；

（3）弃去培养基，用PBS清洗3次后进行常规的细胞收集、蛋白裂解和胰酶酶解；

（4）加入PNGase F和唾液酸酶去除N-糖链和唾液酸；

（5）用C18小柱对酶解肽段除盐随后冻干；

（6）将凝集素与冻干后的肽段样品一起孵育；

（7）将孵育后的凝集素溶液转移至超滤管，进行超滤，并清洗5次以上，洗去未与凝集素结合的非糖蛋肽；

（8）在体系中加入终浓度0.1~1mol/L的GalNAc，孵育0.5~2h，通过单糖竞争作用，将与凝集素结合的O-糖肽释放下来；