[发明专利]一种用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体

说明书

本申请公开了一种用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)人工合成赤霉素生物合成相关基因的cDNA片段：在cDNA片段序列中5’端加入克隆位点EcoRI和3’端加入克隆位点HindIII；(2)pCAMBIA2300瞬时表达载体构建：将pCAMBIA2300空载体进行双酶切，通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300和步骤(1)中的加入克隆位点后的cDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300瞬时表达载体。本发明构建农杆菌瞬时表达载体，建立新的水稻抗恶苗病品种基因鉴定技术体系。实现简单、准确、快速、高通量的对水稻抗恶苗病的抗性筛选鉴定。

技术领域

本发明涉及微生物学基因工程技术领域，特别涉及一种用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体。

背景技术

瞬时表达，即瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，称为瞬时转染表达。随后，游离在细胞中的质粒或DNA片段有两种归化，一种是被降解，还有一种是插入染色体中而能够持续地稳定地表达。

在载体选用方面，瞬时表达可以不需要筛选标签，如常用的NEO抗G418等，但使用稳定表达的载体亦可以用来进行瞬时表达。

植物瞬时表达系统：当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达(transient expression)和稳定表达(stable expression)两种。

在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转化细胞。基因的导入方法可分为间接转基因方法和直接转基因方法。

植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。并且具有如下优点：

①简单快速。转化基因可在转化的一周内进行分析，避免了组织培养等繁杂过程；

②表达水平高。当单链的T-DNA进入植物细胞后，许多未整合到植物基因组中的游离外源基因同样可以表达。

③安全有效。不受植物生长发育过程的影响，不产生可遗传的后代，结果可靠直观，不存在基因漂移的风险。常用基因枪转化和农杆菌真空渗透法

表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp)，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

水稻恶苗病又称徒长病、白秆病，是一种世界性真菌病害，是危害水稻地上部分的一种系统性病害，主要表现为植株徒长、枯死等症状，严重田块可损失达到20％-30％。水稻恶苗病是由子囊菌亚门赤霉属藤仑赤霉菌(无性态为藤仑镰孢菌)侵染引起的真菌病害。病菌在新陈代谢过程中因条件不同，能产生赤霉素或镰刀菌酸等物质。赤霉素能引起稻苗徒长，并可抑制叶绿素的形成；镰刀菌酸却有抑制稻苗生长的作用。水稻孕穗期后造成病株及周围植株长霉枯死，严重影响了水稻的产量。

研究表明水稻恶苗病菌可经种子传代，因此种子带菌检测就显得格外重要。对于水稻种子是否携带有病原真菌，以前主要通过对种子所携带的微生物进行分离培养，再根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定。这种方法不仅分离培养时间长，同时也由于杂菌污染影响分离效果，检出率不高。农杆菌介导的瞬时表达技术是目前研究基因功能的常用方法。瞬时表达技术可以实现目的基因短暂的高水平表达，与稳定遗传表达相比，具有操作简单、所需时间短、耗资少、且不受遗传转化难易的影响等优点。