[发明专利]一种基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

说明书

本发明建立了一种基于LAG‑3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白tagRFP偶联于LAG‑3蛋白羧基末端末端(C端)，以及LAG‑3蛋白胞外域(1‑451aa)羧基末端(C端)，分别构建真核表达载体，并制备LAG‑3‑tagRFP及LAG‑3ex‑tagRFP融合蛋白；将人源MHC II蛋白基因构建在CMV启动子下，绿色荧光蛋白EGFP建在人工复合调控元件E‑Box_AP‑1_CRE序列下，并建立新型的稳转细胞系MHC II.E‑Box_AP‑1_CRE‑d2EGFP/A375，以LAG‑3‑tagRFP或LAG‑3ex‑tagRFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗LAG‑3药的效应，可同时获得阻断功能与LAG‑3/MHC II信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗LAG‑3药物和评估其生物学效应的实验模型。

技术领域

本发明涉及一种基于Lag-3/MHCII靶点及其生物效应的药物快速筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene 3，LAG-3)主要表达于活化的 T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，PDCs)，与主要组织相容性复合体II类分子(majorhistocompatibility complex class Il，MHC II)具有高亲和力，通过对T细胞活化的负调控参与免疫调节。

LAG-3显著表达在霍奇金淋巴瘤的里-斯细胞(Hodgkin/Reed-Sternberg cell，HRS)丰富的区域。淋巴细胞浸润的黑素瘤转移淋巴结不仅包含表达LAG-3的T细胞，也包含较高比例的表达LAG-3的NKT和NK细胞。黑素瘤细胞上MHC II能和 T细胞上LAG-3相互作用。LAG-3也可以活化MHC II阳性的黑色素瘤细胞的丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/ extracellular signal regulated kinase，MAPK/Erk)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B，P13K/Akt)信号通路。不论可溶性 LAG-3还是细胞膜上表达的LAG-3，都能保护MHCII阳性的A375黑素瘤细胞不受 Fas介导的凋亡，也保护MHCII阳性的Mell黑素瘤细胞免于化疗药物依托泊苷介导的凋亡，这些保护作用都和MAPK/Erk和P13K/Akt信号通路有关系。黑色素瘤细胞上LAG-3和MHC II的相互作用正调节MAPK/Erk和P13K/Akt信号通路。因而可利用阻止LAG-3与MHc II相互作用形成复合物作为手段来治疗MHCII阳性的黑色素瘤。

基于LAG-3/MHC II阻断功能的抗癌新药，包括抗Lag-3单抗药、小分子阻断剂、多肽阻断剂等的研发已是目前医药领域热点之一。但目前为止尚未见有关基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的新药快速、高效而精准的筛选系统。

发明内容

本发明的目的是建立了一种基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法。

本发明构思如下：