[发明专利]可变区序列文库构建方法、测序方法及其试剂盒

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及可变区序列文库构建方法、测序方法及其试剂盒。本发明公开了一种可变区序列文库的构建方法，包括以下步骤：步骤一、获得含有编码可变区的DNA样本；步骤二、以所述DNA样本作为模板，通过第一引物群扩增编码所述可变区的DNA序列，获得第一扩增产物库；步骤三、以所述第一扩增产物库作为模板，通过第二引物群和第一接头的引物扩增编码所述可变区的DNA序列，获得可变区序列组合产物。本发明用于解决目前构建TCR或者BCR的可变区序列文库技术存在的扩增效率低、扩增存在偏倚性以及容易丢失可变区序列文库序列信息的技术缺陷。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及可变区序列文库构建方法、测序方法及其试剂盒。本申请要求2018年5月30日提交的PCT(国际申请号为PCT/CN2018/088989)的权益，在此将上述申请的全部内容引用并入本文。

背景技术

“免疫”是人体极其重要的自卫功能，依靠自身的免疫力，能抵御种类庞大的各种疾病，几乎人体内所有的疾病都与免疫息息相关。人体微环境内负责保卫机体的免疫细胞主要有T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞等，这些专职免疫细胞具有独特的结构和功能，并含有独特的免疫细胞亚群和功能分子。T细胞和B细胞是人体主要的淋巴细胞，分别负责细胞免疫和体液免疫，深入了解T细胞和B细胞的组成有助于对疾病的理解、预防与治疗。T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)是由多条肽链组成，具有抗原结合特异性，每条肽链的互补决定区(又称超变区)的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，构成容量巨大的TCR库和BCR库，研究表明亚型越多，越能有效抵抗细菌、病毒等病原体侵袭，亚型越少越容易感染疾病。另外年龄、环境、疾病诱发因素以及用药等也影响着免疫细胞的多样性。由此，免疫组库测序(Immune Repertoire sequencing，简称为IR-SEQ)技术应运而生：它是以多重PCR或5′RACE技术目的扩增CDR区，在结合高通量测序，从DNA或者RNA水平专门研究TCR和BCR的互补决定区的免疫多样性，用于深入挖掘免疫组库与疾病的关联。

目前从DNA水平进行TCR、BCR互补决定区的免疫多样性检测，主要是利用组成TCR、BCR的CDR区的V基因以及J基因片段进行引物的设计，进行CDR区的扩增，然后这部分扩增产物进行加接头，在二代测序进行TCR和BCR多样性的检测。另外一部分研究是从RNA水平进行TCR、BCR互补决定区的免疫多样性检测，主要是利用TCR、BCR的CDR区的末端C区进行逆转录反应，延伸至CDR区的V区端，然后进行产物的扩增，并进行二代测序，分析TCR、BCR多样性。

然而，现有的TCR和BCR多样性的检测的技术仍存在以下问题，首先，利用DNA进行多重PCR对TCR、BCR的CDR区进行扩增，主要存在的问题有，首先是CDR区两端的V，J非常多样，可能每端需要的引物组为几个引物到几十个引物，取决于引物的设计。成套的引物对进行扩增，因为两端的引物组引物多，容易发生模板上引物不匹配，扩增效率相对较低，而一旦形成了主要的扩增子，则容易引起扩增偏倚性。另外一方面，由于二代测序本身的属性，容易在测序过程中引入错误，而目前的多重PCR方案并不能进行校正分析，对于多样性的检测往往带来很大的偏差。其次，利用RNA进行逆转录PCR对TCR、BCR的CDR区进行扩增也同时存在着一些问题，RNA样本的处理难度相比DNA的样本更加的困难，且不稳定，容易发生降解，在样本处理这一环节，已经是更加的容易丢失多样性信息。同时，目前有些方案的逆转录方案需要在延伸最后一个环节进行接头转换，但是现有的接头转换的转换技术的转换率较低，如果不能成功进行接头转换，则在后续的环节中，该部分信息丢失，同样对于多样性结果有较大的偏差。此外，因为每一个T细胞或者B细胞对应一个特有的TCR或者BCR，而RNA样本有可能在一个细胞中进行了大量的转录，无法实现每一个T细胞或者B细胞对应一个特有的TCR或者BCR的对应关系。

综上所述，研发一种高效扩增，无偏倚性，分析结果准确，可以全面构建TCR或者BCR的可变区序列文库的技术方案是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容