[发明专利]一种慢生根瘤菌单加氧酶及其在制备手性亚砜中的应用

说明书

一种慢生根瘤菌单加氧酶、编码该酶的基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备所述单加氧酶的方法，以及利用所述单加氧酶制备光学纯手性亚砜，特别是催化拉唑类前体硫醚不对称氧化制备拉唑类药物的方法。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种慢生根瘤菌单加氧酶、编码该酶的基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备所述单加氧酶的方法，以及利用所述单加氧酶制备光学纯手性亚砜，特别是催化拉唑类前体硫醚氧化制备拉唑类药物的方法。

背景技术

手性亚砜具有广泛而重要的应用价值，它的用途大致可以分为几类：手性辅助试剂、手性配体、手性催化剂以及手性药物和药物中间体。

一些手性亚砜是含有硫原子手性中心药物的重要中间体或药物本身。例如：艾司奥美拉唑为代表的一系列苯并吡唑类质子泵抑制剂，都是手性杂环基亚砜类化合物。质子泵抑制剂(PPIs,Proton Pump Inhibitors)是许多胃食管疾病(如胃及十二指肠溃疡，胃食管反流病)的首选治疗药物，作为H⁺/K⁺-ATP酶抑制剂，具有起效快、作用强、特异性高和持续时间长的特点。目前临床上广泛应用的质子泵抑制剂有奥美拉唑(1988年在瑞典上市)，兰索拉唑(1995年在日本上市)，泮托拉唑(1997年在德国上市)，雷贝拉唑(1999年在美国上市)以及艾司奥美拉唑(2001年在美国上市)。其中兰索拉唑(Lansoprazole)，别名达克普隆(Takepron)，化学名2-[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-哌啶基]甲基亚硫酰基-1H-苯并咪唑，作为新一代质子抑制剂类抗酸药及抗溃疡病药物，强力抑制胃酸分泌。在临床应用中，兰索拉唑的生物利用度较奥美拉唑更高，而单一右旋兰索拉唑缓释胶囊在治愈率、控酸作用持续时间、烧心控制率等几个方面，都比消旋兰索拉唑具有更好的表现。单一右旋兰索拉唑由日本武田制药公司研发，于2009年获得FDA批准在美国上市，此后在欧、亚、美洲等多个国家相继上市。

利用生物催化的方法合成手性亚砜具有立体选择性高、反应条件温和安全、环境友好等优点，是化学方法合成手性亚砜的有益补充，并且随着生物技术的发展已经成为目前研究的热点。虽然可以不对称催化氧化硫醚化合物的生物催化剂种类繁多，但是现有的生物催化剂对大位阻硫醚底物的催化效率极低。亚克(Babiak)等从土壤污染物中筛选到了一株野生菌，经鉴定为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)，使用该菌株生长细胞催化奥美拉唑硫醚的转化，底物上载量为0.1g/L时，发酵培养48h后，转化率仅为77％。WO2011/071982中公开了Codexis公司对来自Acinetobacter sp.NCIMB 9871的环己酮单加氧酶CHMO进行了定向进化，得到的工程酶能够高效催化奥美拉唑硫醚氧化制备(S)-奥美拉唑，尽管如此，目前仍然缺乏能够不对称催化氧化兰索拉唑硫醚的高效催化剂。Codexis公司得到的工程酶能够催化兰索拉唑硫醚生成(R)-兰索拉唑，但是工程酶的催化效率极低，底物上载量为1.5g/L时，17h转化率仅为1.2％，且由于极低的转化率导致无法测定产物的光学纯度。

目前，右旋兰索拉唑仍然采用化学法生产，在现有生产工艺中，不对称催化氧化过程的选择性差、转化率低。手性金属钛试剂和辅剂酒石酸用量大，硫醚剩余约10～15％，杂质砜的含量约2％。由于反应产物杂质多，后处理过程中需要多次萃取结晶，产率低，并且产生大量三废(废水、废气、废液)。而现有的生物催化剂虽然反应条件温和、安全且环境友好，但是转化率较低。

发明内容

本发明针对现有技术中化学法生产亚砜类化合物选择性差、转化率低以及生物催化合成大位阻亚砜类化合物转化率低的问题，提供了一株筛选获得的Bradyrhizobiumoligotrophicum ECU1212。

本发明提供了一种Bradyrhizobium oligotrophicum，其为Bradyrhizobiumoligotrophicum ECU1212，保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15208。