[发明专利]通过非标记的可逆终止子或天然核苷酸的分步测序

权利要求书

1.一种用于检测3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸在引物延伸产物的3'端处的掺入的方法，其中所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸包括核碱基、糖单元和可裂解的阻断基团，所述方法包括：

(a)将(i)包含掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的所述引物延伸产物和(ii)与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸结合的第一亲和试剂组合，其中所述第一亲和试剂与所述核碱基、所述可裂解的阻断基团，或两者结合，以及

(b)检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述糖单元。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述可裂解的阻断基团。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述糖单元。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核碱基是选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的天然核碱基。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一亲和试剂判别：

a)包括腺嘌呤(A)的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)的掺入的可逆终止子；

b)包括G的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与掺入的可逆终止子T、C或A；

c)包括T的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括G、C或A的掺入的可逆终止子；

d)包括C的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤G、T或A的掺入的可逆终止子。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核碱基是核碱基类似物。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述核碱基是腺嘌呤类似物(A')、鸟嘌呤类似物(G')、胸腺嘧啶类似物(T')或胞嘧啶类似物(C')，以及与结合包括相应天然核碱基的掺入的核苷酸相比，所述第一亲和试剂优先结合包括所述类似物的掺入的核苷酸。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂与所述可裂解的阻断基团结合。

10.如权利要求1或权利要求8所述的方法，其中在步骤(d)中，所述引物延伸产物与具有不同结合特异性的2至4种亲和试剂组合，以及一种亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸结合。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种亲和试剂的所述结合鉴定所述核碱基。

12.如前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括(d)去除所述可裂解的阻断基团以产生3'-OH脱氧核糖核苷酸。

13.一种用于检测3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸在引物延伸产物的3'端处的掺入的方法，其中所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸包含核碱基、糖单元和可裂解的阻断基团，所述方法包括：

(a)产生引物延伸产物，其在所述3'端包括3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸；

(b)去除掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的所述可裂解的阻断基团，以产生包括3'-OH单元的3'-OH脱氧核糖核苷酸延伸产物；

(c)将来自(b)的所述延伸产物与结合所述3'-OH脱氧核糖核苷酸延伸产物的第一亲和试剂组合，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述3'-OH单元，以及

(d)检测所述第一亲和试剂与所述延伸产物的结合。

14.如任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括(c)去除所述第一亲和试剂。