[发明专利]构建核酸分子拷贝的方法

权利要求书

1.一种构建包含核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：

(i)通过将核酸分子连接至至少一个衔接子来使其环化，所述衔接子包含至少一个切口内切核酸酶识别位点的至少一部分；

(ii)进行滚环扩增；

(iii)暴露于识别所述识别位点的切口内切核酸酶，使得仅在(ii)中产生的构建体的双链区的一侧产生切口；和

(iv)暴露于包含5'-3'外切核酸酶和/或活瓣内切核酸酶活性的聚合酶。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括直接进行步骤(iv)中产生的构建体连接至适合于测序的衔接子。

3.一种构建核酸分子拷贝的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：

(i)进行滚环扩增；

(ii)用溶解酶脱支，从而溶解三元连结体和其他分支产物；和

(iii)用包含5'-3'外切核酸酶活性的聚合酶和/或连接酶处理，从而使带切口、有缺口或含活瓣的产物免于进一步降解。

4.一种产生包含环状核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述环状核酸分子包含含有至少一个片段的链，所述片段具有在所述链的所述区段与具有与所述区段的所述序列互补的序列的另一区段退火的情况下可被序列特异性切口内切核酸酶识别的序列，所述序列不具有存在于所述链中的其互补序列，所述方法应用于一个或多个环状核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：

(i)将所述环状核酸分子暴露于包含核苷酸和链置换聚合酶的反应溶液，以产生包含所述环状核酸分子的多个拷贝的分支构建体；和

(ii)通过包括以下步骤脱支所述分支构建体：

(a)暴露于识别所述序列的切口内切核酸酶，从而在所述分支构建体上产生切口；和

(b)暴露于包含5'-3'外切核酸酶和/或活瓣核酸酶活性的聚合酶，以在(a)中产生的切口延伸3'末端，从而产生脱支的双链构建体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤在单管反应中进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子通过以下构建：

(i)将双链核酸分子暴露于反应溶液中，所述反应溶液包含外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链但不消化另一条链；和

(ii)将步骤(i)中未消化的链暴露于单链特异性连接酶，从而形成环状分子。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子由双链核酸分子构建，所述双链核酸分子包含至少一条链，所述链包含至少两个彼此至少部分互补的区段，并且所述方法还包括：

(i)将双链核酸分子暴露于反应溶液中，所述反应溶液包含外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链，使另一条链保持完整，所述另一条链包含至少两个彼此至少部分互补的区段；

(ii)通过使所述至少两个彼此至少部分互补的区段退火，允许所述另一条链形成发夹；和

(iii)将步骤(ii)中的发夹连接到发夹衔接子上，从而形成环状核酸分子。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子通过以下构建：

(i)将双链核酸分子暴露于反应溶液中，所述反应溶液包含外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链但不消化另一条链；和

(ii)将步骤(i)中未消化的链暴露于包含连接酶和适用于夹板连接的寡核苷酸的溶液中。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子通过以下构建：

(i)使双链核酸分子变性，从而产生单链；和

(ii)将步骤(i)中的单链暴露于包含连接酶和适用于夹板结扎的寡核苷酸的溶液中。