[发明专利]增强的免疫细胞受体测序方法

权利要求书

1.一种用于对免疫细胞受体基因进行测序的方法，其包括

(1)提供来自免疫细胞的RNA；

(2)(a)任选地将所述RNA转录为互补RNA(cRNA)，然后使用一个或多个包含第一衔接子序列的引物将cRNA逆转录为互补DNA(cDNA)，其中通过逆转录产生的cDNA的每个5’端含有所述第一衔接子序列；

(2)(b)如果没有进行步骤(2)(a)，则将所述RNA逆转录为互补DNA(cDNA)，然后使用一个或多个包含第一衔接子序列的引物将cDNA转录为第二链cDNA，其中将cDNA转录为第二链cDNA而产生的cDNA的每个5’端含有所述第一衔接子序列；

(3)使用第一引物对扩增cDNA以产生第一扩增产物，所述第一引物对包含与第一衔接子序列杂交的第一引物和与免疫细胞受体基因的恒定区杂交的第二引物；

(4)使用第二引物对扩增第一扩增产物以产生第二扩增产物，其中

i.第二引物对的第一引物在第二扩增产物的5’端与该衔接子序列结合，

ii.第二引物对的第二引物与第二扩增产物中的免疫细胞受体基因的恒定区结合，并且

iii.第一和第二引物包含用于测序的衔接子序列；以及

(5)对第二扩增产物进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中逆转录步骤产生150-600bp的PCR产物。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述免疫细胞受体基因为T细胞受体(TCR)基因或B细胞受体(BCR)基因。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物与TCRα链V区段杂交。

5.根据权利要求4所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物包括SEQ ID NO:1-50或SEQ ID NO:261-310中的一个或多个。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物与TCRβ链V区段杂交。

7.根据权利要求6所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物包括SEQ ID NO:51-100或SEQ ID NO:311-360中的一个或多个。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物与TCRγ链V区段杂交。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物与TCRδ链V区段杂交。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物与BCR重链V区段杂交。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物与BCR轻链V区段杂交。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cDNA合成(步骤(2)(b))的一个或多个引物包含核苷酸条形码序列。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核苷酸条形码包含6至20个核苷酸。