[发明专利]加帽和未加帽抗体半胱氨酸的大规模生产工艺及其在治疗性蛋白缀合中的应用

权利要求书

1.一种生成能缀合化学有效载荷的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：

(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包含选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分；

(b)温育所述细胞达到足以耗尽所述生长培养基中所存在的大部分生长组分的细胞密度；和

(c)进一步温育所述细胞以表达具有一个或多个包含游离巯基的未加帽的半胱氨酸残基的含半胱氨酸蛋白。

2.如权利要求1所述的工艺，还包括步骤：

(d)将预先确定的加帽部分或其前体引入到所述表达的含半胱氨酸蛋白；

其中所述蛋白上的一个或多个半胱氨酸用所述预先确定的加帽部分加帽。

3.一种生成能缀合化学有效载荷的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：

(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包括选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分；

(b)温育所述细胞以表达具有一个或多个包含游离巯基的未加帽的半胱氨酸残基的含半胱氨酸蛋白；和

(c)在步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和(b)中，维持所述一种或多种生长组分浓度低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。

4.如权利要求3所述的工艺，还包括步骤：

(d)将预先确定的加帽部分或其前体引入到所述表达的含半胱氨酸蛋白；

其中所述蛋白上的一个或多个半胱氨酸用所述预先确定的加帽部分加帽。

5.一种生成能缀合化学有效载荷的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：

(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包括选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分，和

(b)温育所述细胞以表达具有一个或多个包含游离巯基的未加帽的半胱氨酸残基的含半胱氨酸蛋白，其中所述生长组分在所述温育后的浓度低于2.0mM、低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。

6.如权利要求5所述的工艺，在所述温育步骤后还包括步骤：

(c)将预先确定的加帽部分或其前体引入到所述表达的含半胱氨酸蛋白；

其中所述蛋白上的一个或多个半胱氨酸用所述预先确定的加帽部分加帽。

7.如权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中通过将所述细胞生长培养基的分数半胱氨酸限制比限制到小于1.0x来耗尽所述生长组分。

8.如权利要求7所述的工艺，其中所述比是约：0.95x、0.90x、0.85x、0.80x、0.75x、0.70x、0.65x、0.60x、0.55x、0.50x、0.45x、0.40x、0.35x、0.30x、0.25x、0.20x、0.15x、0.10x或0.05x。

9.如权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中所述含半胱氨酸蛋白选自抗体和融合蛋白。

10.如权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述达到的细胞密度是至少约1E6细胞/mL。

11.如权利要求10所述的工艺，其中所述细胞密度是至少约：5E6细胞/mL、10E6细胞/mL、50E6细胞/mL、100E6细胞/mL或500E6细胞/mL。

12.如权利要求2、4和6中任一项所述的工艺，其中所述预先确定的加帽部分选自5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)、2-巯基吡啶、二硫代联吡啶(DTDP)、4-硫代苯甲酸、2-硫代苯甲酸、4-硫代苯磺酸、2-硫代苯磺酸、磺酸甲酯(Ms)、对甲苯磺酸盐(Ts)和三氟甲基磺酸盐(Tf)。