[发明专利]来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体

说明书

本发明涉及可用于最佳地产生具有人独特型的功能性免疫球蛋白的转基因动物。

技术领域

本发明涉及可用于在啮齿类动物中产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，及所述转基因动物的制备方法。本发明还涉及使用来自细菌人工染色体上被修饰的大区域的多核苷酸及其组合的串联整合来产生人源化和全人抗体的组合物和方法。独立获得的转基因动物的杂交育种允许使用许多不同的、可能全部的人VH、D和JH区段表达高度多样化的人抗体库。通过统一调节单独的整合位点来体内管控表达，以例如获得VH基因多样性和选择而不受干扰。

背景技术

人单克隆抗体(呈具有常规大小的IgG、单链或结构域模块的形式)已被证明在治疗应用中极为有用(Chan和Carter Nature reviews.Immunology 10，301-316(2010)；Enever等，Current opinion in biotechnology 20，405-411(2009))。尽管取得了成功，但所述人单克隆抗体的产生仍然存在重大缺陷，其产生要么依赖于对可用人类材料的特异性选择和后续对单个产品的修饰，要么依赖于对有限可用的转基因动物的免疫化(Brüggemann等，第I部分：Selecting and shaping the antibody molecule，SelectionStrategies III:Transgenic mice，in Handbook of Therapeutic Antibodies.Ed.Dübel，S.Wiley-VHC，69-93(2007))。

人免疫球蛋白(Ig)基因在转基因动物中的DNA重排和表达是20多年前通过在种系构型中稳定地插入重链基因而开创的(Bruggemann，M.PNAS 86，6709-6713(1989))。与非人免疫球蛋白的治疗应用相关的一个问题是所述非人免疫球蛋白在人类患者中具有潜在免疫原性。为了降低此类制剂的免疫原性，已经开发出了各种用于产生嵌合抗体、部分人抗体(人源化抗体)和全人抗体的策略。嵌合抗体包含人恒定区和由非人V基因编码的结合区。在非人动物中产生具有人独特型的转基因抗体的能力是特别理想的，因为抗原结合决定簇位于独特型区域内，并且非人独特型被视为有助于当前抗体治疗剂的免疫原性。就单克隆抗体治疗剂而言，人类独特型是一种特别重要的考虑因素，所述单克隆抗体治疗剂由以相对高的浓度递送的单一独特型组成，而不是由通过多克隆抗体混合物以较低浓度递送的多种独特型组成。

使得人Ig的表达水平提高和排他性产生的主要改进措施结合了以下两种新的策略：胚胎干(ES)细胞中的基因敲除(Kitamura等，Nature 350，423-426(1991))和人工染色体上的基因座延伸(Davies等，Nucleic acids research 21，767-768(1993))。在ES细胞中通过基因打靶使内源性Ig基因沉默产生了几种无活性的小鼠品系，所述失活的小鼠品系无法重排它们的IgH和IgL基因座，或者不产生全功能的IgH、IgK或IgL产物。最近，锌指核酸酶(ZFN)被设计成在Ig基因中产生位点特异性双链断裂，这允许通过缺失和非同源DNA修复来破坏基因。将ZFN质粒注入受精卵中产生具有IgH和IgL破坏的Ig沉默型大鼠和兔(Geurts，A.M.等，Science 325，433(2009)；Menoret，S.等，European journal of immunology 40，2932-2941(2010)；Flisikowska，T.等，PloS one 6，e21045(2011))。