[发明专利]RSPO替代物分子

说明书

提供了(RSPO)替代物组合物及其使用方法。本发明的RSPO替代物包含(i)43(RNF43)或3(ZNRF3)的特异性结合结构域和(ii)细胞靶向结构域。更具体地，其中RNF43或ZNRF3特异性结合结构域是抗体片段，并且其中细胞靶向结构域是细胞因子。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月11日提交的美国序列号62/444,987的优先权，其各自的内容以引用的方式并入本文。

背景技术

进化上保守的Wnt信号传导途径在所有多细胞动物的胚胎发育和成体组织稳态中起关键作用。Wnt蛋白是分泌的脂糖蛋白配体，其控制细胞增殖、迁移、细胞命运规范和极性形成。经典Wnt信号级联通过调节转录辅因子β-连环蛋白的稳定性来驱动特定的基因表达程序。Wnt蛋白还可激活不依赖于β-连环蛋白的平面细胞极性(PCP)途径，以协调细胞和组织的运动。卷曲(Frizzled,FZD)家族的七种跨膜结构域蛋白质作为Wnt蛋白的核心受体，并且它们是Wnt/β-连环蛋白和Wnt/PCP信号传导所需的。Wnt蛋白利用不同的辅助受体激活不同的下游信号传导途径；Wnt蛋白与辅助受体LRP5/6结合以打开Wnt/β-连环蛋白途径，并且它们与辅助受体ROR1/2、RYK或PTK7结合以启动Wnt/PCP途径。

泛素化介导的Wnt受体转换已成为Wnt途径活性的关键调节机制。细胞表面FZD水平由UBPY/USP8和USP6稳定，表明泛素化作为FZD溶酶体降解的重要调节机制。细胞表面跨膜E3泛素连接酶锌和环指3(ZNRF3)及其功能同源物环指蛋白43(RNF43)充当Wnt信号传导的负反馈调节剂。ZNRF3和RNF43通过促进泛素化和随后的Wnt受体FZD和LRP6的内化和降解来抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导。Dishevelled(DVL)通过直接结合FZD作为Wnt信号传导的正调节剂，并且是靶向ZNRF3/RNF43至FZD的衔接蛋白，以促进FZD泛素化和降解。

R-spondin蛋白(RSPO1-4)是分泌蛋白，其有效地使细胞对Wnt/β-连环蛋白信号传导和Wnt/PCP信号传导敏感。所有四种RSPO蛋白均具有相似的结构域结构，具有两个N末端弗林蛋白酶结构域和C末端TSR结构域。LGR4、LGR5和LGR6是RSPO的高亲和力受体；RSPO要求LGR4/5/6激活Wnt信号传导，但其不激活LGR4/5/6下游的经典GPCR信号传导。RSPO通过同时结合ZNRF3/RNF43和LGR4/5/6的细胞外结构域来增强Wnt信号传导，诱导ZNRF3/RNF43的自身泛素化和膜清除，从而导致FZD的细胞表面水平增加。FZD转换的调节解释了RSPO可如何控制Wnt/β-连环蛋白和Wnt/PCP信号传导两者。RSPO通过弗林蛋白酶1和2结构域与LGR4/5/6结合，并通过弗林蛋白酶1结构域与ZNRF3/RNF43结合。RSPO需要与LGR4/5/6和ZNRF3/RNF43两者相互作用以发挥作用。不同RSPO蛋白的Wnt刺激活性与它们对ZNRF3或RNF43的结合亲和力相关。

分泌了多种Wnt拮抗剂，其通过阻断受体通路、隔离Wnt配体或降解Wnt起作用。相比之下，RSPO(Rspo1-4)是Wnt信号传导的唯一分泌增效剂，并已成为体内和体外干细胞维持的关键调节剂。正在探索RSPO用于许多治疗应用，范围从骨再生到化疗后的肠道复壮。RSPO是有吸引力的候选药物，因为它们放大现有的Wnt信号，同时避免全局Wnt激活的潜在致癌或毒性脱靶效应。然而，由于LGR4/5/6在靶细胞类型上的表达的要求，并且由于RNF43/ZNRF3和LGR4/5/6的内在交叉反应性以及RNF43/ZNRF3和LGR4/5/6的广泛组织表达谱将导致许多组织上的RSPO作用，从而导致多效性和不希望的毒性，因此RSPO的临床效用有限。

临床使用Wnt激动剂的潜在障碍包括由于RNF43/ZNRF3介导的拮抗作用和毒性脱靶效应而导致的效力降低。Wnt是有效的形态发生素，并且Wnt途径的超活化涉及几种人类癌症的发展。因此，开发提供可以细胞和组织特异性方式递送的RSPO活性的替代物分子具有大的临床意义。

发明内容