[发明专利]通用发夹引物

说明书

本发明涉及靶核酸扩增的方法及其在测序方法或其他下游应用诸如基因分型或克隆中的用途。更具体地，该方法涉及通过使用通用发夹引物扩增靶核酸的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年3月24日提交的美国临时申请号62/476,108的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

以ASCII文本文件提交的“序列表”、表格、或计算机程序表附页的引用

将2018年3月19日于机器型号IBM-PC，MS-Windows操作系统创建的1,028字节的文件097505-113810PC-1079936_SequenceListing.txt中所记载的序列表全文纳入本文用于所有目的。

背景技术

扩增感兴趣的靶核酸有许多方法。这些方法中的一些，诸如PCR和其衍生方法，广泛应用于分子生物学领域。PCR是一种敏感且特异性的试验，其能够在大量非靶核酸材料中检测微量靶核酸序列。例如，已知基于PCR的方法，用于检测少量DNA诸如来自孕妇血浆样品的无细胞DNA以筛选胎儿非整倍性或检测癌症患者血液样品中的循环肿瘤DNA(ctDNA)，参见例如，美国专利申请号20150147815、20150087535和20160138112，以及美国专利号9,334,541和9,499,870，其公开通过引用纳入本文。

PCR原理的持续扩张使得许多公司投入大量资源来简化核酸文库的制备程序和扩增过程，例如，在水性溶液、微滴、乳液和基于固相的核酸扩增中进行反应(例如，亿明达有限公司(Illumina Inc.)，离子激流公司(Ion Torrent)，454生物科学公司(454LifeSciences)和太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences))。核酸扩增方法的进一步改进导致多重核酸扩增反应的发展，能够在单个反应混合物中扩增数百或数千种核酸靶标，参见例如，美国专利申请号20160369333和美国专利号8,673,560和8,728,728，其公开通过引用纳入本文。相应地，设计引物及其在核酸扩增反应中的功能对于预防和/或降低错误引发和/或失败引发事件的可能性，多重核酸扩增反应的开发以及需要较少优化单个引物浓度而言是十分重要的，因为核酸扩增反应的参数变得更加协调。

核酸扩增反应引物设计的一些参数在本领域中充分记载，诸如百分比GC含量，引物长度，退火和解链温度，5’端稳定性和3’端特异性(Dieffenbach等，述于《PCR方法和应用》(PCR Methods and Applications)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory)，3:S30-S37(1993))。引物设计的另一考虑因素是二级结构的存在，如发夹(茎环)或引物二聚体。通过限制引物引发的可用性及其结合感兴趣的靶核酸的能力，发夹可以大幅度地降低PCR反应的效率。因为存在于引物二级结构内的互补核酸序列，这些二级结构导致失败、不成比例或无效率的核酸扩增。存在这样的多种算法，其允许用户输入潜在的引物设计以确定二级结构的存在(例如，NCBI BLAST-Primer软件、Primer3Plus软件)。通常，舍弃具有显著二级结构的引物，倾向于缺少二级结构的类似引物，以使核酸扩增反应的效率最大化(参见例如，Singh等,Mol Biol.,1(3):67-69(2000))。因此，我们提供了改进的方法、试剂盒和反应混合物，用于扩增核酸。

发明概述

本文提供用于核酸扩增的方法、试剂盒和反应混合物。该方法包括使用第一靶引物对和通用引物对，所述第一靶引物对包含一种或两种靶特异性发夹引物，所述靶特异性发夹引物具有：(i)3'单链靶特异性区，当其处于或低于Tm温度时，(ii)5'区，其在低于Tm温度时形成发夹而在高于Tm温度时不形成所述发夹；所述通用引物对包含一种或两种这样的发夹引物，所述发夹引物具有所述5'区并且没有单链3'端，据在低于Tm温度时所确定。在一些实施方式中，在低于形成发夹的5'区Tm温度的温度时，第一靶引物对的3'单链靶特异性区是单链。在一些实施方式中，在高于、低于或等于形成发夹的5'区Tm温度的温度时，3'单链靶特异性区是单链。