[发明专利]提高细胞基因编辑效率的方法

说明书

本文提供用PFTα或bFGF改善细胞中核酸酶介导基因打靶频率的方法。

相关申请信息

本申请要求于2017年2月1日提交的第62/453,051号美国临时申请的优先权，并通过引用将其整体纳入本文用于所有目的。

政府权益声明

本发明得到国立卫生院(国家人类基因组研究所)第P50 HG005550-05号政府资助。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本文总体涉及基因编辑。

背景技术

现有细胞基因组编辑方法在一个或多个位置切割基因组，例如通过使用核酸酶。采用序列特异性核酸酶的基因组编辑是已知的。核酸酶介导的基因组内双链DNA(dsDNA)断裂可被两种主要机制修复：非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(NHEJ)，前者经常造成引入非特异性的插入和缺失(indels)，后者吸纳同源链作为修复模板。当序列特异性核酸酶与包含所需突变的同源供体DNA构建体一起递送时，基因打靶效率相较仅递送供体构建体提升1000倍。

已经开发出了另外的方法来加速基因组修饰过程，这些方法直接将位点特异性核酸酶的DNA或mRNA注入细胞(例如胚胎细胞)在特定基因座产生DNA双链断裂(DSB)。这些位点特异性核酸酶诱导的DSB然后可被易错的非同源性末端连接(NHEJ)修复，得到例如在切割位点携带缺失或插入的变异小鼠和大鼠。如果连同与DSB两侧末端有同源性的供体质粒共同注入，那么高保真的同源性重组可以产生具有靶向整合的动物。此类基因组编辑方法包括锌指核酸酶(ZNF)或TAL效应子核酸酶(如转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN))。

CRISPR II型系统已被用于编辑多个物种的基因组(参见例如Friedland等，2013；Mali等，2013；Hwang等，2013；Jiang等，2013；Jinek等，2013；Cong等，2013；Yin等，2014)。CRISPR可特别定制，因为活性形式由不变的Cas9蛋白和易于设计的单链向导RNA(sgRNA)组成。Jinek等，2012。各种CRISPR直向同源物中，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes(Sp))CRISPR是认知最充分、应用最广泛的。Cas9-gRNA复合物首先探测原间隔区相邻基序(PAM)序列(对Sp Cas9来说即-NGG)的DNA，此后，sgRNA与靶DNA之间的Watson-Crick碱基配对以棘轮机制进行，形成一个R-环。形成Cas9、sgRNA和靶DNA三元复合物后，Cas9蛋白在靶DNA中产生两个缺口，造成钝端双链断裂(DSB)，这些断裂通过非同源末端连接(NHEJ)途径或模板引导的同源重组(HR)修复。CRISPR方法可见例如US 9,023,649和US 8,697,359。CRISPR/Cas9核酸酶的开发极大地扩展了我们在细胞内工程化定制遗传改变的能力(Mali等，2013)。

在某些方面，如本领域所知，脱氨酶可用来修饰某些核苷酸。脱氨酶被用来修饰细胞DNA。

然而，有些细胞对造成DNA损伤的基因组编辑在基因编辑率或存活率方面有不良反应。因此需要在细胞内工程化定制遗传改变(例如采用CRISPR/Cas9时)的更好的方法，其中遗传修饰的细胞能够形成动物(例如猪)用作器官移植的潜在来源。

发明内容