[发明专利]经修饰贻贝蛋白、其用途和相关化合物

说明书

本发明涉及经修饰贻贝黏着蛋白、其用途、编码所述经修饰贻贝黏着蛋白的核苷酸序列、适用于产生所述经修饰贻贝黏着蛋白的氨酰‑tRNA合成酶、以及光笼化的3，4‑二羟基苯丙氨酸衍生物(特别是邻硝基苄基‑3，4‑二羟基苯丙氨酸)的新用途，所述衍生物包含保护基，可通过用UV光照射其邻苯二酚部分的至少一个羟基残基而从所述3，4‑二羟基苯丙氨酸衍生物残基切割该保护基。

说明书

本发明涉及根据权利要求1的前序部分所述的经修饰贻贝蛋白(musselprotein)、根据权利要求8、9、11和12的前序部分所述的这样的经修饰贻贝蛋白的不同用途、根据权利要求13的前序部分所述的编码这样的经修饰贻贝蛋白的核酸、根据权利要求14的前序部分所述的适用于制备这样的经修饰贻贝蛋白的氨酰-tRNA合成酶、根据权利要求15的前序部分所述的这样的氨酰-tRNA合成酶的用途、和根据权利要求16的前序部分所述的邻硝基苄基-3，4-二羟基苯丙氨酸的新用途。

在医学中，存在长期以来对生物相容性胶的需求，其可用于治疗骨折或加速伤口愈合，以替换目前存在的有限的利用针(pin)和钉(nail)的治疗方法。¹生物相容性生物胶必须满足数个要求，例如与组织的良好结合强度(黏着)，在生理、潮湿条件下的高稳定性(内聚力)，可控的生物降解性，在生物体中无免疫原性以及无毒性。²然而，目前没有满足这些要求的生物胶。虽然生物胶(例如纤维蛋白)显示出弱结合强度和迅速生物降解，而合成胶(例如氰基丙烯酸酯)显示出强结合特性，但对生物体³具有潜在毒性且不可吸收，因此损害内源性骨修复。¹

在海洋贻贝中发现可满足上述要求的生物胶，所述生物胶能够通过其基于蛋白质的胶将自身粘在潮间带中的水下固体表面。^4，5为了能够黏着，贻贝制造所谓的足丝(byssus)，其由数个蛋白质线组成，其最终呈现为黏着斑。黏着斑与表面直接接触，并且由不同的贻贝黏着蛋白(mussel adhesive protein，MAP)构成，其允许在多种有机和无机表面上形成强力、永久的黏着。拉伸强度高至10MPa⁶，其在松质骨(约5MPa)的范围内。⁷儿茶氨基酸3，4-二羟基苯丙氨酸(Dopa)是水下黏着的关键参与者，其是由酪氨酸翻译后形成的。Dopa通过多种机制(例如氢键、金属配位或醌介导的交联)促进黏着。⁴MAP具有高至30mol％的高Dopa含量，反映了Dopa对贻贝黏着的高重要性。

由于来自贻贝的提取产量低，已做了很多努力以通过利用酶促体外羟基化步骤、酪氨酸酶的共表达或通过利用真核表达系统以使酪氨酸残基翻译后羟基化而合成贻贝激发聚合物^8，9或重组产生MAP^10，11。虽然这些方法分别具有低结合强度、低羟基化效率或低蛋白质产量的缺点，但最近通过利用大肠杆菌(E.coli)酪氨酰tRNA合成酶(Tyrosyl tRNAsynthetase，TyrRS)的底物耐受性，在大肠杆菌中进行了酪氨酸与Dopa¹¹的残基特异性替换。然而，该方法具有大肠杆菌TyrRS对Dopa的活化率差以及由于蛋白质组广泛并入Dopa而导致细胞生长受损的缺点。

本发明的一个目的是提供用于产生包含Dopa的蛋白质、特别是包含Dopa的贻贝蛋白，以及提供相应的经修饰贻贝蛋白质本身的新系统和合适的工具。

特别地，该目的通过具有权利要求1的特征的经修饰贻贝蛋白实现。这样的贻贝蛋白包含至少一个3，4-二羟基苯丙氨酸衍生物残基而不是在经修饰贻贝蛋白的各自天然类似物(例如，天然存在的贻贝蛋白)中天然存在的氨基酸。因此，3，4-二羟基苯丙氨酸衍生物残基在其邻苯二酚部分的至少一个羟基残基上包含保护基。其也可表示为受保护的3，4-二羟基苯丙氨酸衍生物残基。

在一个实施方案中，经修饰贻贝蛋白是经修饰贻贝黏着蛋白。在下文中，术语“经修饰贻贝蛋白”总是涵盖经修饰贻贝黏着蛋白，并且可限于本实施方案。