[发明专利]分离新抗原-特异性T细胞受体序列的方法

权利要求书

1.分离配对的T细胞受体TCRα和β链序列或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：

(a)从生物样品分离对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性的T细胞；

(b)与呈递经突变的氨基酸序列的抗原呈递细胞APC一起共培养经分离的T细胞，使得所述T细胞表达一种或多种T细胞活化标志物；

(c)将共培养的T细胞分选成单独的单T细胞样品；

(d)从每个单独的单T细胞样品分离mRNA；

(e)对来自每个单独的单T细胞样品的mRNA进行测序，其中所述测序包括：

(i)从所述mRNA产生cDNA并扩增所述cDNA；

(ii)产生经扩增的cDNA的多个片段和标记所述多个片段；

(iii)扩增所述cDNA的经标记的多个片段；和

(iv)对所述cDNA的经扩增的标记的多个片段进行测序；

其中所述测序鉴定所述cDNA的多个片段中的每一个的序列；

(f)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与一种或多种T细胞活化标志物的已知序列比对，以鉴定哪个单T细胞样品含有表达一种或多种T细胞活化标志物的单个T细胞；

(g)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与参考TCR序列数据库比对，以鉴定在(f)中鉴定的表达一种或多种T细胞活化标志物的每个单独的单T细胞样品的cDNA的多个片段的TCRα链可变V区段序列和TCRβ链V区段序列；

(h)在含有(g)中鉴定的所述TCRα链V区段序列的所述cDNA的多个片段中和在含有(g)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列的所述cDNA的多个片段中鉴定TCR互补决定区3CDR3序列；

(i)对共用相同α链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目和共用相同β链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目进行计数；

(j)收集编码相同α链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段、编码相同β链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段，

以鉴定所述TCRα和β链CDR3序列；

(k)鉴定(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRα链V区段序列，(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRβ链V区段序列，

以鉴定所述TCRα和β链V区段序列；和

(l)组装编码以下的一条或多条核苷酸序列：

TCRα链，其包含(k)中鉴定的所述TCRα链V区段序列和(j)中收集的TCRα链CDR3序列，和

TCRβ链，其包含(k)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列，

以产生经分离的配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中(j)还包括收集编码相同α链CDR3序列的cDNA的第二高数目的多个片段，其中由cDNA的第二高数目的多个片段编码的α链CDR3序列不同于由cDNA的最高数目的多个片段编码的α链CDR3序列，(k)还包括鉴定(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列，以及(l)还包括组装编码以下的第二一条或多条核苷酸序列：

第二TCRα链，其包含(k)中鉴定的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列和(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链CDR3序列，和

所述TCRβ链，其包含(k)中鉴定的TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种T细胞活化标志物包括以下中的一种或多种：干扰素IFN-γ、白介素IL-2、肿瘤坏死因子αTNF-α、程序化细胞死亡1PD-1、淋巴细胞活化基因3LAG-3、T细胞免疫球蛋白和粘液素结构域3TIM-3、4-1BB、OX40、CD107a、颗粒酶B、粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-17和IL-22。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括用针对每个单独的单T细胞样品的不同标签标记来自每个单独的单T细胞样品的mRNA。