[发明专利]单倍体机能不全的基因疗法

权利要求书

1.一种治疗哺乳动物对象中单倍体机能不全疾病的方法，所述方法包括使所述对象的细胞与组合物接触，所述组合物包含：

i)向导RNA，其中所述向导RNA包含：

a)靶向区域，其在所述细胞的核中存在的条件下，与和单倍体机能不全的基因的野生型拷贝操作性地连接的启动子区域或增强子区域特异性杂交；和

b)CRISPR核酸酶结合区域，其在所述细胞的核中存在的条件下特异性结合CRISPR核酸酶，或特异性结合CRISPR核酸酶结合区域的区域；和

ii)CRISPR核酸酶，

-其中所述接触形成包含与向导RNA结合的CRISPR核酸酶的复合物，其中所述复合物中向导RNA的靶向区域与所述启动子或增强子杂交；

-其中所述复合物包含催化失活的CRISPR核酸酶和转录激活结构域，并且

-其中所述复合物以足以治疗所述对象中的单倍体机能不全疾病的量和持续时间激活单倍体机能不全的基因的野生型拷贝的转录。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述接触包括使细胞与编码向导RNA或CRISPR核酸酶的附加型载体接触。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述接触包括使细胞与编码向导RNA和CRISPR核酸酶的附加型载体接触。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述接触包括使细胞与编码向导RNA的附加型载体和编码CRISPR核酸酶的第二附加型载体接触。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体是非整合的。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体是非复制性的。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体是腺相关病毒(AAV)载体。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体独立地包含第一末端和第二末端，其中第一末端和第二末端各自独立地包含AAV反向末端重复序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶包含(i)经修饰以消除核酸酶和切口活性的核酸酶结构域和(ii)转录激活结构域。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰包括在对应于化脓性链球菌Cas9的D10和H840的位置处的突变。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶包含D10A，H840A化脓性链球菌dCas9。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含死亡指导序列。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含转录激活结合结构域，其中所述转录激活结合结构域特异性结合包含一种或多种转录激活结构域的组合物。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含与向导RNA结合的CRISPR核酸酶的所述复合物还包含选自下组的转录激活结构域：HSF1，VP16，VP64，p65，MyoD1，RTA，SET7/9，VPR，组蛋白乙酰转移酶p300，TET家族蛋白的羟化酶催化结构域(例如，TET1羟化酶催化结构域)，LSD1，CIB1，AD2，CR3，EKLF1，GATA4，PRVIE，p53，SP1，MEF2C，TAX和PPARγ。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶是CRISPR核酸酶-VP64融合多肽。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含支架区域。