[发明专利]稳定的VAMP报告子检测

说明书

本申请提供了一种多肽，其包含具有荧光素酶活性的N‑末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C‑末端多肽结构域，其中VAMP代表囊泡相关膜蛋白。还提供了相应的核酸分子、表达载体和遗传修饰的细胞。本发明还提供了这些的方法和用途。

本申请提供了一种多肽，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域，其中VAMP代表囊泡相关膜蛋白。还提供了相应的核酸分子、表达载体和遗传修饰的细胞。本发明还提供了这些的方法和用途。

背景技术

破伤风是由破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起的急性毒素介导的疾病。在有利的厌氧条件下，例如在坏死的伤口中，这种无处不在的杆菌可以产生破伤风毒素——一种非常强效的神经毒素。破伤风神经毒素(本文也称为“TeNT”或“TNx”)阻断中枢神经系统中的抑制性神经传递，导致特征性肌肉僵硬和痉挛(1)。即使有现代化重症监护，病死率也很高(高达80％)。

破伤风神经毒素和相关的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是大型多结构域蛋白，主要由于它们与神经元特异性神经节苷脂和蛋白质的相互作用而以高亲合力结合神经元(1,5)。该结合由50kDa的结合结构域介导，该结合结构域在结构上与效应部分分开。在神经元结合后，神经毒素被内化到内吞囊泡中，由于酸化，它们在内吞囊泡中经历构象变化。这种pH引发的结构变化使得蛋白酶(也称为轻链)释放到蛋白水解靶标所在的胞质溶胶中。具体的蛋白水解靶标将取决于具体的神经毒素，其中破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素和G型肉毒杆菌神经毒素均裂解囊泡相关膜蛋白(VAMP)1、2和3(尽管在不同的裂解位点)。

VAMP1、2和3对于神经传递是必需的，它们的裂解导致神经递质分泌的阻断，这可能导致死亡(1,5)。例如，VAMP2的裂解导致神经递质释放的强效阻断，随后发生神经肌肉麻痹。不幸的是，裂解的VAMP2很快被未知的神经元内机制降解，因此几乎不可能检测到裂解的VAMP2分子。

在人和受监管的动物中，通过用含有破伤风类毒素(一种去毒形式的TeNT)的疫苗进行免疫来预防破伤风。破伤风类毒素由TeNT制备，通过用甲醛将其去毒，而不破坏其免疫特性。破伤风疫苗的生产包括(i)TeNT的生产、(ii)TeNT的化学灭活和(iii)检测残留的TeNT活性(2)。生产方法使得类毒素不应恢复到毒素。

在破伤风疫苗的生产过程中，残留神经毒素活性的检测是必不可少的。几十年来，用于评估破伤风产品安全性的传统工具几乎没有变化，评估仍然依赖于啮齿动物生物测定，其中致死效应与神经肌肉麻痹相关。根据WHO指南，每个新的类毒素批次必须在豚鼠或小鼠中进行残留TeNT麻痹活性检测(2)。动物安全性检测是昂贵、费力且耗时的(3,4)。即使在疫苗生产之后，还要对破伤风疫苗的储存特性进行另外的啮齿动物生物测定，以确定可能的TeNT活性逆转。考虑到WHO最近宣布了其目标：人类完全抗破伤风覆盖率达到80亿，需要新的、先进的且更有效的方法来生产和评估破伤风类毒素。

尽管用破伤风类毒素进行泛人类(pan-human)免疫已经达到了WHO的目标，但是许多家养动物不仅针对破伤风而且还针对D型肉毒杆菌进行了常规免疫(6)。肉毒杆菌疫苗还必须在开发过程中进行测试，以确定是否存在任何残留的神经毒素活性。对于破伤风疫苗，通常使用啮齿动物生物测定来评估肉毒杆菌疫苗的安全性。

需要新的动物替代测定来检测破伤风类毒素和肉毒杆菌类毒素的残留神经毒素活性。此外，B型肉毒杆菌神经毒素是一种受批准的药物，需要对其效力进行检测。一般认为，动物替代测定应说明神经毒素作用的所有三个步骤：细胞表面结合、内在化和底物(例如VAMP2)裂解。迄今为止，两个主要问题阻碍了这种基于细胞的检测方法的发展：缺乏能与破伤风神经毒素和肉毒杆菌神经毒素牢固结合的连续细胞系，以及裂解产物的快速降解(因此无法检测神经毒素作用的产物)。

发明内容