[发明专利]用于高水平生产CRM的改进方法

权利要求书

1.一种用于生产CRM₁₉₇的方法，所述方法包括使白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的非去铁发酵培养基中生长，其中所述氨基酸不是酪氨酸或天冬酰胺，并且其中所述非去铁发酵培养基不含麦芽糖。

2.根据权利要求1所述的方法，包括向所述发酵培养基补充营养物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，向所述发酵培养基补充营养物包括使用代谢流。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述大于10种氨基酸选自由以下组成的组：丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述大于10种氨基酸以0.05g/L至2g/L的量存在于所述非去铁发酵培养基中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非去铁发酵培养基以小于1g/L的量包含苯丙氨酸和精氨酸。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述营养物选自由以下组成的组：烟酸、硫胺素、泛酸、生物素、核黄素、叶酸、庚二酸、磷酸盐、氮源和微量金属。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非去铁发酵培养基包含基础发酵培养基，其中所述基础发酵培养基包含酵母提取物，蔬菜蛋白胨，磷酸二氢钾，色氨酸和葡萄糖。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用葡萄糖补充所述非去铁发酵培养基。

10.一种生产CRM₁₉₇的方法，所述方法包括：

i)在包含基础培养基和选自由丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐组成的组中的大于10种氨基酸的非去铁发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的白喉棒状杆菌菌株，和

ii)使用代谢流向所述非去铁发酵培养基补充葡萄糖和营养物，其中所述非去铁发酵培养基不含麦芽糖。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法在30至40℃的温度和7.0至8.0的pH下进行。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法产生大于150mg/L且小于或等于500mg/L的CRM₁₉₇。

13.一种生产CRM₁₉₇的方法，所述方法包括在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的非去铁发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的白喉棒状杆菌菌株，和使用代谢流向所述非去铁发酵培养基中补充营养物，其中所述大于10种氨基酸中的每种以0.05g/L至2g/L的量存在于所述非去铁发酵培养基中，其中所述氨基酸不是酪氨酸或天冬酰胺，并且其中所述非去铁发酵培养基不含麦芽糖。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法在30至40℃的温度和7.0至8.0的pH下进行。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法产生大于150mg/L且小于或等于500mg/L的CRM₁₉₇。