[发明专利]单核苷酸检测方法及相关探针

权利要求书

1.对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸的流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个所述单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点5'侧并包括用于捕获所述单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，和位于所述识别位点5'侧的至少一个荧光团区域，其被布置为使所述荧光团被猝灭，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于所述捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在所述识别位点切割所述经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有所述荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有3'-5'核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的所述荧光团。

2.对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸的流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个所述单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点3'侧并包括用于捕获所述单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，以及位于所述识别位点3'侧的至少一个荧光团区域，其被布置为使所述荧光团被猝灭，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于所述捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在所述识别位点切割所述经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有所述荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有5'-3'核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的所述荧光团。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)在连接酶的存在下进行，以在所述识别位点附近产生基本上双链的经使用的探针。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，通过使所述第一寡核苷酸为闭环或通过在其中包括双链区来实现所述核酸外切酶封闭位点。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶是适于仅切割所述第一寡核苷酸的切口核酸内切酶。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，迭代步骤(2)和(3)，并且在所述迭代之后或与所述迭代同时进行步骤(4)。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述经使用的探针包括第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含第二寡核苷酸、核苷三磷酸和第三寡核苷酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸通过接头区连接。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第四寡核苷酸包含闭环。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二和/或第三寡核苷酸对所述限制性核酸内切酶的切割具有抗性。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光团区域包括猝灭剂以猝灭所述荧光团。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)在比步骤(2)更高的温度下进行，和/或步骤(4)在比步骤(3)更高的温度下进行。