[发明专利]用于产生重折叠的重组人源化兰尼单抗的方法

权利要求书

1.一种用于产生重折叠的重组人源化兰尼单抗的方法，所述方法包括：

a)将携带编码抗体片段的重链和轻链的核苷酸序列的载体转化到宿主细胞中，所述核苷酸序列具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：3；

b)使宿主细胞经历高密度细胞发酵；

c)通过在包含葡萄糖和IPTG的混合物的存在下进行诱导在宿主细胞的细胞质中以相等的比例共表达所述抗体片段的轻链和重链以获得包涵体。

2.根据权利要求1所述的用于产生重折叠的重组人源化抗体片段的方法，所述方法还包括：

a)在增溶缓冲液的存在下使含有等比例的重组抗体片段的轻链和重链的包涵体溶解，从而获得溶解的抗体片段轻链和重链；和

b)通过稀释变性剂，然后在氧化剂的存在下氧合以触发二硫键的氧化来重折叠所述溶解的抗体片段轻链和重链，从而获得生物活性形式的rHu兰尼单抗；

c)通过使用5KDa切向流过滤装置对步骤(v)中获得的所述rHu兰尼单抗进行超滤，随后20mM Tris pH 9.0。

3.如权利要求2所述的方法，其中使用包含0.1M Tris缓冲液pH 9.0、2mM EDTA、变性剂和还原剂的增溶缓冲液进行增溶。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述变性剂选自盐酸胍或尿素。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。

6.根据权利要求2所述的方法，其中通过加入10mM氧化型谷胱甘肽，然后使纯氧以1SLPM(标准升每分钟)的流速进入体外重折叠过程而使所述溶解的抗体片段轻链和重链进行氧化。

7.根据权利要求2所述的方法，其中通过使用包含0.1M Tris pH9.0、0.6M精氨酸，5％山梨糖醇、2mM EDTA的重折叠缓冲液进行重折叠。

8.一种用于表达rHu兰尼单抗的轻链和重链基因的二重(双顺反子)载体表达系统，其中所述二重载体包含编码轻链的核苷酸序列SEQ ID No：3、编码重链的核苷酸序列SEQ IDNo：1、启动子序列和限制性位点。