[发明专利]用于产生人少突胶质细胞和研究体外髓鞘形成的个性化3D神经培养系统

权利要求书

1.一种用于产生人相互作用的髓鞘性少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的3D培养物的方法，所述方法包括：

(i)通过在包含有效剂量的BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养多能干细胞的完整集落或单细胞聚集体达2到10天的时段在多能干细胞悬浮培养物中诱导神经命运，以生成漂浮球状体的群体；

(ii)通过在包含成纤维细胞生长因子2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)的培养基中以悬浮培养物形式进行培养1到4周而使漂浮球状体的群体分化为神经祖细胞的球状体；

(iii)通过在缺乏FGF2和EGF并且包含有效剂量的PDGF-AA、IGF-1、HGF、BDNF、NT3、胰岛素、cAMP、T3和生物素的神经培养基中培养而使神经祖细胞的球状体分化为包括少突胶质细胞的人少突球状体(hOS)；

(iv)将所述hOS球状体在神经培养基中维持延长的时间段，以产生包括相互作用的髓鞘性少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的3D培养物，其中，所述神经培养基缺乏生长因子但包括抗坏血酸、胰岛素、cAMP、T3和生物素。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞包含至少一个与髓鞘障碍相关的等位基因。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述BMP抑制剂为多索吗啡，以及所述TGFβ抑制剂为SB-431542。

5.如权利要求4所述的方法，其中(i)中的所述悬浮培养物不含饲养层。

6.如权利要求1所述的方法，其中，从培养的第二天开始，(i)中的所述培养基还包含有效剂量的wnt抑制剂。

7.如权利要求1所述的方法，其还包括用音猬因子途径激动剂和视黄酸或用音猬因子途径激动剂和Wnt抑制剂对步骤(i)中的球状体进行培养。

8.如权利要求1所述的方法，其还包括通过流式细胞术、磁性免疫选择或免疫淘选从少突球状体中分离少突胶质细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其中将分离的少突胶质细胞暴露于目的候选试剂或治疗。

10.如权利要求9所述的方法，其中将所述少突胶质细胞与神经元或神经祖细胞组合。

11.一种用于确定候选试剂对人少突胶质细胞的影响的方法，所述方法包括：使所述候选试剂与根据权利要求7所述的方法分化自人诱导多能干细胞(hiPSC)的一种或一组所述3D培养物接触，其中所述少突胶质细胞任选地包含至少一个编码与神经疾病相关的突变的等位基因；以及确定所述试剂对形态、遗传或功能参数的影响。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述候选试剂是免疫效应细胞。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述候选试剂是免疫调节剂。

14.如权利要求11所述的方法，其中一组少突胶质细胞包括至少两种具有不同基因型的少突胶质细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述一组少突胶质细胞包含在不同环境条件下的少突胶质细胞。