[发明专利]DNA被编辑了的真核细胞的制造方法、和在该方法中使用的试剂盒

说明书

成功地在真核细胞中建立了CRISPR‑Cas3系统。

技术领域

本发明涉及DNA被编辑了的真核细胞、动物、和植物的制造方法、以及在该方法中使用的试剂盒。

背景技术

细菌、古细菌具有特异性地识别、排除要从外来侵入的噬菌体等生物的适应免疫机制。被称为CRISPR-Cas系统的该系统首先将外来生物的基因组信息插入自身基因组(适应)。然后，在相同外来生物再次要侵入时，利用插入到自身基因组中的信息与基因组序列的互补性，切断、排除外来基因组(干扰)。

最近，使用上述CRISPR-Cas系统作为“DNA编辑用的工具”的基因组编辑(DNA编辑)技术被开发出来(非专利文献1)。

CRISPR-Cas系统在切断DNA的过程中发挥作用的效应物大致分为由多个Cas形成的“1类”、和由单一Cas形成的“2类”。尤其是作为1类的CRISPR-Cas系统，由Cas3和级联复合体(是指级联与crRNA的复合体。以下同样)参与的“I型”广为人知，作为2类的CRISPR-Cas系统，由Cas9参与的“II型”广为人知(以下，关于CRISPR-Cas系统，也有时将“1类I型”和“2类II型”分别仅称为“I型”和“II型”)。并且，在到目前为止的DNA编辑技术中大范围使用的是由Cas9参与的2类的CRISPR-Cas系统(以下，有时也称为“CRISPR-Cas9系统”)。例如，非专利文献1报告了使用Cas9切断DNA的2类的CRISPR-Cas系统。

另一方面，对于使用Cas3和级联复合体切断DNA的1类的CRISPR-Cas系统(以下，也有时称为“CRISPR-Cas3系统”)虽然进行了大量努力，但尚未报告在真核细胞中基因组编辑的成功例。例如，非专利文献2和3中报告了仅通过使用CRISPR-Cas3系统，在无细胞体系中目标DNA完全被分解、能够选择性地除去特定的大肠杆菌株，但这些并不意味着基因组编辑的成功，另外在真核细胞中没有任何证实。另外，在专利文献1中，根据CRISPR-Cas3系统通过Cas3的解旋酶活性和外切核酸酶活性而在大肠杆菌中分解目标DNA(实施例5、图6)，而提出在真核细胞中代替Cas3使用FokI核酸酶来进行基因组编辑(实施例7、图7、图11)。另外，专利文献2中，根据CRISPR-Cas3系统在大肠杆菌中分解目标DNA(图4)，而提出通过使cas3缺失、使用钝化的Cas3(Cas3’和Cas3”)，而向可程序化的基因抑制进行再目的化(例如，实施例15、权利要求4(e))。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2015-503535号公报

专利文献2：日本特表2017-512481号公报

非专利文献

非专利文献1：Jinek M et al.(2012)A Programmable Dual-RNA Guided DNAEndonuclease in Adaptive Bacterial Immunity,Science,Vol.337(Issue 6096),pp.816-821

非专利文献2：Mulepati S&Bailey S(2013)In Vitro Reconstitution of anEscherichia coli RNA-guided Immune System Reveals Unidirectional,ATP-dependent Degradation of DNA Target,Journal of Biological Chemistry,Vol.288(No.31),pp.22184-22192