[发明专利]寡核苷酸保存方法

说明书

本发明涉及：寡核苷酸保存方法；以及包含寡核苷酸的试剂盒。本发明提供了通过预先向所述含有寡核苷酸的溶液中添加核酸结合蛋白的用于稳定地保存含有寡核苷酸的溶液的方法。

技术领域

本发明涉及寡核苷酸贮存方法和用于扩增靶核酸的试剂盒。

背景技术

DNA合成用于研究中的各种目的。其中，排除单链DNA的化学合成的大多数DNA合成使用DNA聚合酶或逆转录酶通过酶促方法执行。可以在体外容易地扩增所需的DNA片段的聚合酶链反应（下文称为PCR）是非常有用的，并且是生物学、医学和农业领域以及其它领域中的必需工具。在通过PCR的DNA扩增中，经常需要高反应特异性。为了减少非特异性扩增，已开发了新型DNA聚合酶，并且已优化了反应混合物（下文称为反应溶液）的组成。然而，仍然需要改善的PCR扩增特异性。

一般地，在通过PCR的DNA扩增中，反应溶液含有成分例如模板核酸、引物、脱氧核糖核苷酸和酶。在检测经扩增的DNA的情况下，反应溶液可以进一步含有荧光染料或探针。为了实现稳定和准确的DNA合成反应，重要的是适当地贮存这些成分，直到将它们提供给反应溶液或开始PCR。

能够将引物或探针作为固体或溶液（包括冷冻溶液）贮存。固体具有因其稳定性而可以在室温下贮存的优点，同时它具有其必须溶解以用于反应溶液中的缺点。另一方面，贮存于溶液中的引物或探针可以立即用于反应溶液中。此外，可以通过预先制备且贮存含有PCR所需的所有成分（例如引物、探针、脱氧核糖核苷酸和酶）的反应溶液来快速执行PCR。然而，在溶液中贮存具有缺乏稳定性的缺点。换言之，当将引物或探针贮存在溶液中时，使用该引物或探针的PCR的反应性趋于降低。尽管可以通过在低温或冷冻温度下贮存溶液来抑制反应性的降低，但需要更有效的贮存方法。

为了改善PCR的反应性和特异性的目的，已进行了各种改善。例如，可以将表面活性剂或某种类型的蛋白加入PCR。随着PCR的改善，报道了添加非离子表面活性剂的技术（专利文献1）。另外，已知具有核酸结合活性的蛋白，例如与单链核酸结合的蛋白，在核酸合成反应例如PCR中抑制非特异性核酸的合成（专利文献2）。与单链核酸结合的蛋白的实例包括大肠杆菌衍生的SSB和T4噬菌体衍生的SSB（也称为T4基因32蛋白）。此外，已报道了用于改善DNA合成反应的反应性的方法，所述方法包括在DNA合成反应溶液的制备中添加冷激蛋白（专利文献3）。

冷激蛋白从各种微生物中发现，并且被认为涉及将生长温度转换至低温的适应。其中，关于被称为主要冷激蛋白的CspA，其基因从大肠杆菌中分离，并且产生重组体（专利文献4）。CspA具有与单链DNA或单链RNA结合的特性。

如上所述，已知具有核酸结合活性的蛋白对DNA合成反应具有有益作用。在如上所述的方法中，在合成反应马上开始之前将蛋白加入反应溶液中。然而，关于含有引物或探针的溶液的长期贮存，尚未对蛋白的作用进行研究。

引用列表

专利文献

专利文献1：美国专利号6127155

专利文献2：美国专利号5773257

专利文献3：WO2009/108949

专利文献4：WO90/09444。

发明概述

本发明要解决的问题

如上所述，存在以溶液状态贮存引物或探针缺乏稳定性的问题。此外，本发明人已发现了一个问题：即使引物或探针在低温下以溶液状态贮存或冷冻保存，它也可以缺乏稳定性（例如，实施例1）。本发明的目的是提供稳定地贮存含有寡核苷酸如引物或探针的溶液的方法。

问题的解决方案

作为解决上述问题的勤奋努力的结果，本发明人已发现，可以通过预先向含有寡核苷酸的溶液中添加核酸结合蛋白来稳定地贮存寡核苷酸。因此完成了本发明。