[发明专利]一种磷脂酶D突变体、其应用及其制备磷酯酰丝氨酸的方法

说明书

一种磷脂酶D突变体、其应用及其制备磷酯酰丝氨酸的方法，涉及生物酶催化技术领域，提供一种酶活力更偏向于磷脂酰转移活性的磷脂酶D突变体，与野生型磷脂酶D的氨基酸序列相比，该磷脂酶D突变体在第93位、第105位、第215位、第216位、第228位和第486位的至少一个位点处有突变。

技术领域

本发明涉及生物酶催化技术领域，特别涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的磷脂酶D突变体及其用于催化制备磷酯酰丝氨酸的方法。

背景技术

磷脂酶D(Phospholipase D，英文简称PLD)属于磷脂酰二酯合成酶类，可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，基于PLD所具有的这种转酯活性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂、稀有磷脂以及系列功能性磷脂，现已成为合成和改造磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等稀有磷脂的重要工具酶。

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，英文简称PS)又名丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸、复合神经酸等，是一类普遍存在于细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中的一种重要的膜磷脂，通常位于细胞膜的内层，是细胞膜的活性物质，尤其存在于大脑细胞中。其功能主要是改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑记忆功能等。由于PS具有很强的亲脂性，吸收后能够迅速通过血脑屏障进入大脑，起到舒缓血管平滑肌细胞，增加脑部供血的作用，被誉为继胆碱和“脑黄金”DHA之后的一大新兴的“智能营养素”。

磷脂酰丝氨酸的制备方法主要包括提取法和酶转化法。提取法主要是从植物(大豆、葵花籽等)、动物(牛、羊、马)的大脑中提取，但由于原料中的PS含量较低且提取工艺复杂，导致该方法成本较高，不利于现代化工业生产。目前工业上主要采用酶转化法生产磷脂酰丝氨酸，其是利用磷脂酶D催化卵磷脂(来源于大豆、葵花籽、鸡蛋等)和L-丝氨酸发生转磷脂酰基反应生成磷脂酰丝氨酸，由于该方法中的原料来源广泛，且原料中的目标物质含量较高，所以其生产成本较提取法大大降低，已经被广泛应用于工业生产中。

但是，天然的磷脂酶D除了具备磷脂酰转移活性—可将卵磷脂和丝氨酸转化成磷脂酰丝氨酸(PS)以外，还具备磷脂酰胆碱水解活性，在有水存在的环境中，磷脂酶D会催化水解卵磷脂产生磷脂酸(phosphatidic acid，PA)和胆碱。而PS的酶转化制备方法的反应体系中不可避免会有水的参与，这就导致部分卵磷脂不能成功转化为PS，从而在很大程度上降低了PS的产率，增加了制备成本。

发明内容

本发明的目的在于降低磷脂酶D的磷脂酰胆碱水解活性对酶转化法制备磷脂酰丝氨酸的产率的影响，开发一种酶活力更偏向于磷脂酰转移活性的磷脂酶D，从而提高酶转化法制备磷脂酰丝氨酸的产率。

为实现上述目的，发明人应用重组DNA技术对野生型磷脂酶D进行定点突变筛选，筛选到一些PS合成活性大幅度提高的突变体，从而提供了一种磷脂酶D突变体，与如SEQ IDNO：2所示的野生型磷脂酶D的氨基酸序列相比，本发明的磷脂酶D突变体在第93位、第105位、第215位、第216位、第228位和第486位的至少一个位点处有突变。

优选地，与如SEQ ID NO：2所示的野生型磷脂酶D的氨基酸序列相比，本发明的磷脂酶D突变体具有K93A、V105M、G215S、G216S、Q228A和N486Y中的至少一个突变。即，本发明的磷脂酶D突变体的突变为K93A、V105M、G215S、G216S、Q228A和N486Y中的任意一个，或者为K93A、V105M、G215S、G216S、Q228A和N486Y中的任意两个或者两个以上的组合。

更优选地，与如SEQ ID NO：2所示的野生型磷脂酶D的氨基酸序列相比，本发明的磷脂酶D突变体的突变为K93A、V105M、Q228A、N486Y、G215S/K93A或G216S/Q228A。

本发明还提供了一种基因序列，该基因序列编码本发明提供的上述磷脂酶D突变体。